藥物分析學(xué)課件：第十五章 甾體激素類藥物的分析

1、第十五章 甾體激素類藥物的分析Analysis of Steroid Hormones2022/8/41 第一節(jié) 基本結(jié)構(gòu)與分類1第二節(jié) 理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)2第三節(jié) 特殊雜質(zhì)與檢查 3第四節(jié) 含量測(cè)定4第五節(jié) 體內(nèi)甾體激素類藥物分析52022/8/424616ABCD1235789101112131415171819基本結(jié)構(gòu)環(huán)戊烷駢多氫菲C-13-雌甾烷C-10，C-13-雄甾烷C-10，C-13 ，C-17-孕甾烷2022/8/43甾體激素性 激 素腎上腺皮質(zhì)激素 雄性激素孕激素雌激素 分 類蛋白同化激素2022/8/44 腎上腺皮質(zhì)激素43酮基C17-醇酮基氫化可的松C17-羥基12345

2、678910111213141516172022/8/45腎上腺皮質(zhì)激素醋酸地塞米松12345678910111213141516172022/8/46腎上腺皮質(zhì)激素地塞米松磷酸鈉12345678910111213141516172022/8/47腎上腺皮質(zhì)激素曲安奈德12345678910111213141516172022/8/481. 具有孕甾烷母核（C10,13,17）,母核21個(gè)碳原子；2. A環(huán)有4-3-酮基，部分藥物在1,2位有雙鍵；3. C17-醇酮基，多數(shù)藥物有17-羥基，部分藥物-醇酮基上的醇羥基與酸成酯；4. C6或C9鹵素取代；5. C11羥基或酮基取代。腎上腺皮質(zhì)激素

3、2022/8/49雄性激素甲睪酮123456789101112131415161718192022/8/410雄性激素丙酸睪酮2022/8/411蛋白同化激素苯丙酸諾龍2022/8/412雄性激素與蛋白同化激素1. A環(huán)有4-3-酮基；2. C17為羥基或成酯；3. 雄性激素母核19個(gè)碳原子， 蛋白同化激素母核18個(gè)碳原子（10位無(wú)角甲基）。2022/8/413孕激素C17-甲酮基黃體酮123456789101112131415161718192022/8/414孕激素醋酸甲地孕酮123456789101112131415161718192022/8/415炔諾酮孕激素炔諾孕酮2022/8/4

4、16孕激素1. A環(huán)有4-3-酮基；2. C17有甲酮基或乙炔基；3. 17位有羥基或被酯化。2022/8/417雌性激素雌二醇2022/8/418雌性激素炔雌醇2022/8/419雌性激素1. A環(huán)有苯環(huán)，C3有酚羥基；2. C17有羥基或成酯，有些C17上有乙炔基。2022/8/420 甾體激素結(jié)構(gòu)小結(jié)2022/8/421結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1. 腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團(tuán)性 質(zhì)43酮UV、與羰基試劑反應(yīng) C17醇酮基還 原 性2022/8/4222.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團(tuán)性 質(zhì)43酮UV、與羰基試劑反應(yīng) C17羥基可成酯2022/8/4233. 孕激素主要活性基團(tuán)性 質(zhì)43酮UV、與

5、羰基試劑反應(yīng)C17甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)2022/8/4244. 雌性激素主要活性基團(tuán)性 質(zhì)A環(huán)為3OH 苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17 乙炔基與AgNO3反應(yīng)C17羥基可成酯2022/8/425第二節(jié) 理化性質(zhì)與鑒別試驗(yàn)（一）理化性質(zhì) （二）鑒別實(shí)驗(yàn)2022/8/4261 溶解性：溶于氯仿；甲醇乙醇微溶；不溶于水；2 熔點(diǎn)：mp3 比旋度：甾體激素多數(shù)有手性碳原子，具有旋光性。（不對(duì)稱物質(zhì)具有旋光性，當(dāng)偏振光透過(guò)1 dm，樣品濃度為1 g/ml的溶液，在一定波長(zhǎng)和溫度下測(cè)得的旋光度稱為比旋度。）（一）理化性質(zhì)2022/8/427吸收系數(shù)：在給定的波長(zhǎng)、溶劑和溫度等條件下，吸光物質(zhì)在單

6、位濃度、單位液層厚度時(shí)的吸光度。反映了藥物的紫外吸收特征43酮：240nm附近最大吸收A環(huán)苯環(huán)并酚羥基：280nm最大吸收（一）理化性質(zhì)2022/8/4282022/8/429（二）鑒別試驗(yàn)薄層色譜法 制備衍生物測(cè)定熔點(diǎn) 高效液相色譜法 紫外分光光度法 紅外分光光度法 化學(xué)鑒別法鑒別試驗(yàn) 2022/8/430（一）化學(xué)鑒別法1.與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)甾體激素類藥物呈色 H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl母核的一般鑒別試驗(yàn)2022/8/431藥 物顯 色熒 光加水稀釋醋酸可的松黃或微帶橙X顏色消失溶液澄清 炔雌醇橙紅黃綠玫瑰紅色絮狀沉淀炔雌醚橙紅黃綠紅色沉淀潑尼松橙X黃至藍(lán)綠潑尼松龍深紅X紅色

7、消失，有灰色絮狀沉淀 與硫酸顯色反應(yīng)2022/8/432與硫酸顯色反應(yīng)2022/8/4332 官能團(tuán)的反應(yīng)（1）C17 -a-醇酮基 腎上腺皮質(zhì)激素類藥物特征反應(yīng)。 C17 醇酮基有強(qiáng)還原性，與氧化劑作用，被氧化還原析出沉淀或顯色，生成水合醛。氧化劑 ：堿性酒石酸銅試液（紅色沉淀）、氨制硝酸銀試液（銀沉淀）、堿性四氮唑藍(lán)試液四氮唑試液水合醛水合醛2022/8/434甾酮類激素藥物腙（黃色）羰基試劑（2） C3酮基和C20酮基常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼2022/8/4352022/8/436具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物藍(lán)紫色 亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛（3

8、）甲酮基2022/8/437黃體酮藍(lán)紫色亞硝基鐵 氰化鈉其他甾體淡橙色或不顯色黃體酮特征鑒別反應(yīng)2022/8/438雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸（4） 酚羥基雌二醇2022/8/439含炔基的甾體激素銀鹽沉淀硝酸銀（5） 炔烴的沉淀反應(yīng)2022/8/440有機(jī)氟F有機(jī)破壞有機(jī)氯Cl（6） 有機(jī)鹵素茜素氟藍(lán) 硝酸亞鈰硝酸硝酸銀AgCl 呈藍(lán)紫色 2022/8/4412022/8/442 一般先進(jìn)行水解，生成相應(yīng)的羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行鑒別。（醋酸酯類藥物）（7） 酯的反應(yīng)2022/8/443-3-酮、苯環(huán)、其他共軛結(jié)構(gòu)（二） UV 法1. 結(jié)構(gòu)依據(jù)240nm左右280nm左右2022

9、/8/4442. 示例 2022/8/445結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17 OH；C17 乙炔基炔雌醇（三） IR法結(jié)構(gòu)特征：-3-酮、C17-甲酮基黃體酮2022/8/446（四） TLC法 主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別 方法：對(duì)照品法 要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。2022/8/447（五） HPLC法 主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏） 方法：對(duì)照品法 要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。2022/8/448鑒別2022/8/449練習(xí)1 甾體激素類藥物的基本母核是 （ ）A環(huán)狀丙二酰脲

10、 B硫氮雜蒽母核 C環(huán)戊烷并多氫菲 D苯并二氫吡喃C-巴比妥類-吩噻嗪類-維生素E2022/8/450練習(xí)2 腎上腺皮質(zhì)激素類藥物C17位上的-醇酮基可用于鑒別的性質(zhì)是（ ）A還原性 B氧化性 C水解性 D酸堿兩性A與四氮唑試液、氨制硝酸銀、堿性酒石酸銅反應(yīng)2022/8/4513練習(xí)B甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)；C17 甲酮基-孕激素；黃體酮藍(lán)紫色；其他孕激素-不顯或淡橙色。2022/8/4524 在酸性溶液中，不能與異煙肼試劑反應(yīng)，生成黃色化合物的甾體激素有（ ）A 黃體酮 B 睪丸素 C 炔雌醇 D 可的松 E 地塞米松練習(xí)C異煙肼-羰基試劑與羰基試劑反應(yīng)-C3酮基和C20酮基2022/8

11、/4535 含炔基的甾體激素類藥物遇下列哪個(gè)試液，可生成白色沉淀（ ）AHCl BAgNO3 CNaNO3 DCuSO4練習(xí)B炔基+硝酸銀-炔銀（白色）2022/8/4546 配伍A 顯有機(jī)氟化物的鑒別反應(yīng)； B 硫色素反應(yīng)；C 加氨制硝酸銀，生成白色沉淀；D 與重氮苯磺酸反應(yīng)生成紅色偶氮染料。炔雌醇-（ ）地塞米松磷酸鈉-（ ）苯甲酸雌二醇-（ ）練習(xí)CAD2022/8/455硒的檢查有關(guān)物質(zhì)的檢查 殘留溶劑的檢查 游離磷酸鹽的檢查 三、 特殊雜質(zhì)檢查2022/8/456（一）有關(guān)物質(zhì)的檢查 檢查意義：其他甾體與甾體激素藥物結(jié) 構(gòu)相似，也有一定的藥理作 用而又互不相同.雜質(zhì)：原料、中間體、異

12、構(gòu)體、降解產(chǎn)物、試劑、溶劑。2022/8/457檢查方法（具有一定分離能力） TLC法（高低濃度對(duì)比法） HPLC法（類似高低濃度對(duì)比法）2022/8/458（1）TLC法主成分自身對(duì)照法（高低濃度對(duì)照法）即將供試品制成高、低二種濃度的溶液。高濃度溶液作為供試溶液；低濃度作為對(duì)照溶液。判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色地塞米松磷酸鈉中其他甾體的檢查2022/8/459（2）HPLC法（主成分自身對(duì)照法） 判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積2022/8/460藥物二氨基萘比色法測(cè)定氧瓶燃燒(二）硒的檢查有毒來(lái)源 合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫2022/8/461（三）有機(jī)溶劑

13、殘留量的檢查甲醇 0.3丙酮 5.0% 內(nèi)標(biāo)法 + 校正因子以地塞米松磷酸鈉為例 _法GC2022/8/462供 試 液鉬 酸 銨 1-氨基-2-萘酚-4-磺酸. 鉬藍(lán)：740nm對(duì)照液：同法 要求：供試品溶液吸光度 不得大于對(duì)照溶液吸光度（四）游離磷酸鹽的檢查2022/8/463雜質(zhì)檢查2022/8/464比色法 紫外分光光度法含量測(cè)定高效液相色譜法 四、含量測(cè)定2022/8/465（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RPHPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對(duì)利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾）測(cè)定對(duì)象：甾體激素類藥物的原料和制劑2022/8/466示例：地塞

14、米松磷酸鈉的含量測(cè)定色譜條件：固定相 ODS，流動(dòng)相 三乙胺溶液-甲醇-乙腈（55:40:5）檢測(cè)波長(zhǎng)242nm系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：n7000，地塞米松磷酸鈉峰和地塞米松峰分離度應(yīng)大于4.4離子對(duì)液相色譜2022/8/4672022/8/468流動(dòng)相真空脫氣機(jī)四元泵自動(dòng)進(jìn)樣器紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器2022/8/469液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜檢測(cè)器2022/8/470流動(dòng)相：對(duì)于以C18為固定相的反相色譜系統(tǒng)，常用甲醇-水，間或加以乙腈、緩沖液等為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑比例通常不低于52022/8/471四元泵2022/8/472自動(dòng)進(jìn)樣器2022/8/473填充劑常用：十八烷基硅烷鍵合硅膠2022/

15、8/474檢測(cè)器2022/8/4752022/8/476（二）UV法-3-酮 240nm（）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯環(huán) 280nm（）雌激素2022/8/4771.四氮唑比色法 2.異煙肼比色法 3. Kober反應(yīng)比色法 （三）比色法2022/8/478 腎上腺皮質(zhì)激素類C17-醇酮基強(qiáng)還原性（1）原理1. 四氮唑比色法有色甲瓚四氮唑鹽醇酮基-a-17COH -還原2022/8/479三苯甲瓚深紅氯化三苯四氮唑（TTC）紅四氮唑（RT）H2022/8/480藍(lán)四氮唑（BT）525 nm2022/8/481（2）方法對(duì)照品法25氫氧化四甲基銨對(duì)照液供試液ATTC4045暗例

16、：氫化可的松乳膏的含量測(cè)定方法2022/8/482（3）討論A. 基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11= O C17OHC21OH C21-酯ABCD12357891011121314151718192022/8/483B. 溶劑、水分的影響 以無(wú)醛乙醇為溶劑，水含量大時(shí)，呈色減慢，不超過(guò)5對(duì)結(jié)果沒(méi)有影響C. O2與光線的影響避光隔絕空氣、快速、充N22022/8/484D. 堿的種類及加入順序以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序：皮質(zhì)激素四氮唑鹽堿試液2022/8/485E. 溫度與時(shí)間室溫（25）反應(yīng)4045 min2022/8/4862022/8/487腎上腺皮質(zhì)激素、 雄性激素和蛋白同化激素、孕激

17、素C3酮基（1） 原理異煙腙（黃）酮基異煙肼-3CHCl（縮合）2. 異煙肼比色法420 nm2022/8/4882022/8/489（2）方法對(duì)照品法60異煙肼無(wú)水甲醇對(duì)照液供試液A暗602022/8/490（3）討論反應(yīng)速度（反應(yīng)專屬性）A.C3=OC17= O 、C20= O C11= O 不反應(yīng)反應(yīng)專屬性 C3酮基2022/8/491B. 溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽受溶解度的影響無(wú)水甲醇無(wú)水乙醇對(duì)試劑的穩(wěn)定性好、呈色強(qiáng)度較無(wú)水乙醇中高、但對(duì)植物油的溶解度小2022/8/492 C.水分、溫度、O2與光線的影響 含水量腙水解A%O2與光線對(duì)反應(yīng)的影響不大t 2022/8/493 酸:異煙肼

18、= 2:1最大吸收度鹽酸濃度0.0074mol/L異煙肼濃度0.00365mol/LD. 酸的種類和濃度及異煙肼的濃度2022/8/494(1) 原理H2SO4-乙醇加熱H2Omax=465加熱雌激素黃色桃紅max=5153. Kober反應(yīng)比色法2022/8/495雌二醇-3-甲醚max=465nmmax=515nm2022/8/496鐵酚試劑(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚* 鐵鹽的作用 加快黃色產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化 加強(qiáng)紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性* 酚的作用 加快紅色產(chǎn)物的形成 消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光2022/8/497荷移反應(yīng), 形成穩(wěn)定荷移絡(luò)合物 炔雌醇（雌激素）炔

19、諾孕酮（孕激素）雌激素特征反應(yīng) 2022/8/498含量測(cè)定方法總結(jié)2022/8/4991 紫外分光光度法測(cè)定具有苯環(huán)的雌激素類藥物，在下列哪個(gè)波長(zhǎng)附近有最大吸收（ ）A235nm B280nm C253nm D240nm練習(xí)B240nm-4-3-酮基2022/8/41002甾體激素類藥物采用薄層色譜法檢查其他甾體的方法為（ ）A高低濃度對(duì)比法 B外標(biāo)法 C內(nèi)標(biāo)法 D比較法練習(xí)A2022/8/41013 地塞米松磷酸鈉中游離磷酸鹽的檢查方法是 （ ）A 三氯化鐵比色法B HPLC法C 紅外分光光度法D TLC法E 磷鉬酸比色法練習(xí)E2022/8/41024 練習(xí)A可的松-腎上腺皮質(zhì)激素-C17

20、-醇酮基-還原性2022/8/4103異煙肼比色法測(cè)定甾體激素類藥物時(shí)，藥物的呈色基團(tuán)是（ ）A酮基 B酚羥基 C甾體母核 D炔基 練習(xí)AC3酮基-羰基試劑反應(yīng)2022/8/41046 Kober反應(yīng)是指_與硫酸-乙醇的呈色反應(yīng)。 練習(xí)雌激素2022/8/4105TLC 法檢查“有關(guān)物質(zhì)”，采用自身稀釋對(duì)照法進(jìn)行檢查時(shí)，所用的對(duì)照溶液是 （ ）A 所檢雜質(zhì)的對(duì)照品B 規(guī)定使用的對(duì)照品C 所檢藥物的對(duì)照品D 規(guī)定對(duì)照品的稀釋液E 供試品的稀釋液練習(xí)E2022/8/4106配伍練習(xí)ABDC2022/8/4107第五節(jié) 體內(nèi)甾體激素類藥物分析1藥物代謝研究 2生物利用度研究 3違禁藥物監(jiān)測(cè) 2022

21、/8/41081方法的專屬性強(qiáng) 此類分析的特點(diǎn)：給藥劑量很小2藥物濃度低3分析方法的靈敏度較高42022/8/4109競(jìng)技運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)違禁甾體激素藥物的分析 LC-MS測(cè)定法3 在線固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME) 技術(shù)3HPLC- UV測(cè)定法4方法3 Saito K, Yagi K, Ishizaki A, Kataoka H. Determination of anabolic steroids in human urine by automated in-tube solid-phase microextraction coupled wit

22、h liquid chromatographymass spectrometry. J of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 52: 7277334 Konieczna L, Plenis A, Oledzka I, Kowalski P, BAczek T. Optimization of LC method for the determination of testosterone and pitestosterone in urine samples in view of iomedical studies and anti-d

23、oping esearch studies. Talanta, 2011, 83: 804-8142022/8/4110對(duì)受試對(duì)象給藥，一定時(shí)間后采集尿樣加內(nèi)標(biāo)物，調(diào)節(jié)PH，加酶進(jìn)行水解一段時(shí)間，離心，取上清液。用上述制的的樣品，進(jìn)行SPME處理，分離純化后經(jīng)LC-MS分析示例1：尿中違禁同化激素的SPME/LCMS檢查2022/8/4111 圖：志愿受試者尿樣中睪酮等七種違禁甾體激素藥物的LC-MS測(cè)定 十一烯酸去氫睪酮苯丙酸諾龍睪酮甲睪酮異雄酮雄酮司坦唑醇內(nèi)標(biāo)2022/8/4112左炔諾孕酮血漿藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究 左炔諾孕酮是一種高效的孕激素，作為速效避孕藥，廣泛應(yīng)用于臨床和計(jì)劃生育。有文獻(xiàn)報(bào)道，建立LC-MS/MS法檢測(cè)血漿中左炔諾孕酮的方法，