常用病原學(xué)檢測精選課件

1、診斷學(xué)第1頁，共54頁。2臨床病原學(xué)檢查山東大學(xué)劉金玲第2頁，共54頁。臨床病原體檢查目的臨床病原體檢查目的:是確定感染的發(fā)生和性質(zhì)，在疾病早期提供恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?，并采取有效的預(yù)防措施，防止感染傳播造成的危害。第3頁，共54頁。各種不同病原體的實(shí)驗(yàn)診斷方法遵循以下基本原則1.正確、規(guī)范采集和運(yùn)送標(biāo)本。2.直接顯微鏡查見病原體或檢出病原體抗原，借助分子生物學(xué)的方法檢測病原體核酸，結(jié)合病人的病史、癥狀或體征，快速作出初步診斷。3.初步診斷同時(shí)，對(duì)病原體進(jìn)行分離與鑒定。4.檢測機(jī)體對(duì)病原體的免疫產(chǎn)物。5.參與臨床選擇抗菌藥物，指導(dǎo)和監(jiān)控微生物的治療方案，避免 耐藥菌株的產(chǎn)生。第4頁，共54頁。5病原

2、學(xué)診斷細(xì)菌學(xué)診斷病毒學(xué)診斷真菌學(xué)診斷 第5頁，共54頁。致病菌的檢驗(yàn)程序和常用項(xiàng)目標(biāo)本直接涂片染色鏡檢分離培養(yǎng)形態(tài)特征生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)明確診斷初步診斷血清學(xué)診斷細(xì)菌的快速鑒定形態(tài)學(xué)檢查（常規(guī)培養(yǎng)或特殊培養(yǎng)）（凝集試驗(yàn)、 沉淀反應(yīng)、免疫標(biāo)記技術(shù)等）(微生物數(shù)字編碼分類鑒定法、血培養(yǎng)自動(dòng)化檢測系統(tǒng)、核酸雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等）藥物敏感試驗(yàn)第6頁，共54頁。7細(xì)菌感染檢查檢驗(yàn)特點(diǎn)通過對(duì)標(biāo)本直接顯微鏡檢，病原菌的分離培養(yǎng)鑒定，病原菌的抗原檢測，核酸檢測和細(xì)菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)物的測定及藥物的測定及藥物敏感性試驗(yàn)，對(duì)細(xì)菌感染性疾病可作出及時(shí)、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷。第7頁，共54頁

3、。Diagnosis Strategy for Bacterial Infection第8頁，共54頁。9 革蘭陽性菌(Gram positive bacteria) 革蘭陰性菌(Gram negative bacteria)涂片結(jié)晶紫 染色碘液媒染酒精脫色復(fù)紅復(fù)染革蘭染色法（Gram Stain）由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立。1.步驟第9頁，共54頁。直接涂片染色鏡檢適用于具有特征性形態(tài)和染色性的病原菌,如葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌、抗酸染色陽性的結(jié)核分枝桿菌等。第10頁，共54頁。大多數(shù)細(xì)菌的形態(tài)與染色并無顯著特異性，因此需要分離培養(yǎng)。如腸道桿菌均為G-桿菌

4、，菌落形態(tài)亦相同。培養(yǎng)特征：化膿性鏈球菌-小而透明、溶血環(huán)。分離培養(yǎng)第11頁，共54頁。生化試驗(yàn)：如腸道桿菌進(jìn)行乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。血清學(xué)試驗(yàn)：已知抗體測抗原或已知抗原測病人血清中相應(yīng)的抗體。如玻片凝集，鑒定菌種和型。動(dòng)物試驗(yàn)：測定細(xì)菌的毒力、病原菌的分離和鑒定。分離培養(yǎng)第12頁，共54頁。血清學(xué)診斷原理：已知抗體測未知抗原進(jìn)行病原菌的鑒定或用已知抗原檢測患者體液中有無相應(yīng)特異性抗體和其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。標(biāo)本：雙份血清標(biāo)本，恢復(fù)期血清抗體效價(jià)比急性期升高4倍者方有意義。單份血清效價(jià)超過一定標(biāo)準(zhǔn)才有診斷意義。種類：凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。第13頁，共54頁

5、。常用的血清學(xué)診斷方法 類型診斷應(yīng)用舉例直接凝集試驗(yàn)傷寒和副傷寒（肥達(dá)試驗(yàn)）、立克次體（外斐試驗(yàn)）、鉤端螺旋體（顯微凝集試驗(yàn)）乳膠凝集試驗(yàn)檢測腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌等抗體沉淀試驗(yàn)梅毒（VDRL、RPR試驗(yàn)）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測Q熱柯克斯體等抗體中和試驗(yàn)風(fēng)濕熱（抗O試驗(yàn)）ELISA廣泛用于病原體的診斷和流行病學(xué)調(diào)查第14頁，共54頁。玻片凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)第15頁，共54頁。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)第16頁，共54頁。細(xì)菌的快速鑒定API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)第17頁，共54頁。PCR技術(shù)第18頁，共54頁。19姬姆薩染色衣原體包涵體HSV病毒被支原體感染的精子梅毒螺旋體第19頁，共54頁。20 檢測程序第

6、20頁，共54頁。病毒感染的微生物學(xué)檢查法第21頁，共54頁。Diagnosis Strategy for Viral Infection 第22頁，共54頁。23病毒感染的微生物學(xué)檢查法第23頁，共54頁。ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity第24頁，共54頁。病毒的數(shù)量與感染性測定蝕斑測定：準(zhǔn)確滴定病毒感染性的方法蝕斑（Plaque）每個(gè)蝕斑是由一個(gè)有感染性病毒顆粒形成，稱為蝕斑形成單位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感

7、染量用PFU/ml表示50%感染量（ID50）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50）不能準(zhǔn)確地測定感染性病毒顆粒的數(shù)量第25頁，共54頁。乙型肝炎的病原學(xué)診斷 第26頁，共54頁。A病毒性肝炎Hepatitis Virus腸道傳播腸道外傳播F, TTV? 其他ENANBBDC病毒性肝炎- 背景第27頁，共54頁。 傳染源糞便血液/血源性物質(zhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液糞便傳播途徑糞-口經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜糞-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎類型ABCDE基因組類型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNA第28頁，共54頁。Hepat

8、itis B Virus乙型肝炎的病原體在全世界廣泛流行，估計(jì)全球半數(shù)以上人口已被HBV感染過，5%的人口為HBV慢性感染中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達(dá)9.8%第29頁，共54頁。HBV virionThe infectious virion is called the DANE particle.第30頁，共54頁。HBV Viral Genome OrganizationHBsAgHBcAgHBeAg3200 Base Pair GenomeHepatocyte receptor bindng siteHBV DNA PolymeraseProtein that transac

9、tivates transcriptional promotors第31頁，共54頁。Both comprised of HBsAg第32頁，共54頁。HBV nomenclatureHBV: hepatitis B virusHBsAg: hepatitis B virus surface antigenHBsAb: hepatitis B virus surface antibodyHBcAg: hepatitis B virus core antigenHBcAb: hepatitis B virus core antibodyHBeAg: hepatitis B virus e ant

10、igenHBeAb: hepatitis B virus e antibody第33頁，共54頁。抗原組成-HBsAg位于病毒表面，是一種糖蛋白4種亞型(adr,adw,ayr,ayw)歐美國家: adw我國漢族: adr我國少數(shù)民族: ayw判斷HBV感染的指標(biāo)之一刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體即抗-HBs第34頁，共54頁?？乖M成- HBcAg位于Dane顆粒核心部分和肝細(xì)胞核內(nèi)，在血清中不易檢出游離的HBcAg主要成分是蛋白質(zhì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBc(非保護(hù)性抗體)在乙肝急性期、恢復(fù)期和HBsAg攜帶者中常可檢出抗-HBc抗-HBc IgM常提示病毒處于復(fù)制狀態(tài)第35頁，共54頁?？乖M成- H

11、BeAg位于HBV的核心,是一種可溶性蛋白抗原HBeAg和Dane顆粒出現(xiàn)相平行，且與DNA多聚酶在血中的消長動(dòng)態(tài)相符合血中HBeAg的出現(xiàn)可作為HBV復(fù)制及血清有感染性的指標(biāo)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗-HBe抗-HBe能與受染肝細(xì)胞表面的e抗原結(jié)合,通過補(bǔ)體介導(dǎo)破壞受染的肝細(xì)胞,抗-HBe的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象第36頁，共54頁?？乖M成- Pre-S抗原位于HBV的外衣殼上，有兩種刺激機(jī)體產(chǎn)生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻斷HBV與肝細(xì)胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用抗Pre-S1和抗Pre-S2的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨向痊愈第37頁，共54頁。傳染源患者潛伏期急性期慢性期無癥狀HBsAg攜帶

12、者第38頁，共54頁。 各種體液中HBV的濃度高中等低/不能檢出血液精液尿血清陰道分泌物糞便傷口滲出物唾液汗液淚液乳汁第39頁，共54頁。血源性傳播輸血、注射、外科和牙科手術(shù)、針刺等剃刀、牙刷和蚊蟲叮咬等母嬰垂直傳播宮內(nèi)傳播分娩時(shí)微小皮損處傳播產(chǎn)后母嬰密切接觸性傳播HBV 傳播途徑第40頁，共54頁。高 (8%): 占45%一生感染的危險(xiǎn) 60%嬰幼兒感染常見中等 (2%7%): 占43% 一生感染的危險(xiǎn)是 20%60%感染存在于所有年齡組低 (2%): 占12%一生感染的危險(xiǎn) 20%許多感染發(fā)生在成人危險(xiǎn)組Global Patterns of Chronic HBV Infection第41

13、頁，共54頁。第42頁，共54頁。病原學(xué)診斷-抗原抗體檢測項(xiàng)目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM方法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性)發(fā)光免疫分析(定量)反相間接血凝試驗(yàn)(少用)第43頁，共54頁。ELISA的基本原理利用抗原和抗體特異性結(jié)合主要的試劑固相抗原或抗體酶標(biāo)記的抗原或抗體酶的底物第44頁，共54頁。ELISA的主要方法間接法: 測定抗-HBs夾心法：測定HBsAg和HBeAg競爭法：測定抗-HBc中和法：測定抗-HBe捕捉法：測定抗-HBc IgM第45頁，共54頁。病原學(xué)診

14、斷(二)-核酸檢測核酸雜交探針PCR引物第46頁，共54頁。HBsAg 感染的標(biāo)志Anti-HBs 既往感染/接種疫苗Anti-HBc IgM 急性感染標(biāo)志Anti-HBc IgG 既往或慢性感染HBeAg 急性病毒復(fù)制，有傳染性 Anti-HBe 病毒不再復(fù)制HBV-DNA 急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準(zhǔn)確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)第47頁，共54頁。血清學(xué)檢測的臨床意義HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 臨床意義急性或慢性感染(大三陽)+-+-+乙肝后期或慢性感染(小三陽)-+-潛伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢復(fù)期,有免疫力-+-痊愈,有免疫力疫苗接種或曾經(jīng)感染過,有免

15、疫力第48頁，共54頁。SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitre第49頁，共54頁。第50頁，共54頁。IgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0481216202428323652YearsWeeks after ExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypica