微生物學(xué)課件：3 細(xì)菌的生化反應(yīng)

1、細(xì)菌的生化反應(yīng)所謂細(xì)菌的生化反應(yīng)，是指利用生物化學(xué)的原理，來(lái)測(cè)定細(xì)菌對(duì)各種物質(zhì)的代謝能力、代謝途徑、代謝方式以及代謝產(chǎn)物的不同，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒別鑒定的方法。細(xì)菌的生化反應(yīng)類型很多，但若按其基本原理來(lái)區(qū)分，則主要包括“糖（醇）類代謝試驗(yàn)”、“蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)”、“有機(jī)酸鹽和銨鹽的利用試驗(yàn)”、“呼吸酶及其它酶類檢測(cè)試驗(yàn)”這四個(gè)基本內(nèi)容。第一節(jié) 糖（醇）類代謝試驗(yàn)所謂糖醇類代謝試驗(yàn)是指測(cè)定細(xì)菌對(duì)各種糖（醇）和糖苷的代謝能力、代謝途徑、代謝方式、代謝產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定的一類試驗(yàn)。糖的種類很多，有單糖、雙糖、多糖；醇和糖苷的種類也很多，但臨床上常用的有：?jiǎn)翁牵浩咸烟?、阿拉伯糖、鼠李糖?

2、甘露糖、果糖、木糖及半乳糖；雙糖：蔗糖、乳糖、蕈糖、麥芽糖；多糖：肝糖、菊糖、糊精、淀粉等。醇類主要有：山梨醇、側(cè)金盞花醇、 甘露醇、衛(wèi)矛醇、肌醇、肝油等。糖苷類主要有：水楊苷、七葉苷等一、 糖醇類發(fā)酵試驗(yàn) 1、原理：將細(xì)菌接種到含有單一的某種可分解糖（醇、糖苷）的液體、半固體或固體培養(yǎng)基中，由于不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇、糖苷）的酶，所以分解糖（醇、糖苷）的能力有所不同。若細(xì)菌能分解某種糖（醇、糖苷），則可產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的ph值下降，使酸堿指示劑呈現(xiàn)酸色。細(xì)菌分解糖醇類產(chǎn)酸后，有的細(xì)菌還能將酸性物質(zhì)繼續(xù)分解，產(chǎn)生氣體，有的不能繼續(xù)分解酸性物質(zhì)，不能產(chǎn)生氣體。由于不同細(xì)菌分解糖

3、（醇、糖苷）的能力不同，分解后的代謝產(chǎn)物也不同，故此類試驗(yàn)可作為鑒別細(xì)菌的重要依據(jù)。 2、培養(yǎng)基：糖（醇、糖苷）類發(fā)酵培養(yǎng)基，含糖（醇、糖苷）濃度一般為510g/L（0.51%），并在培養(yǎng)基中加入酸堿指示劑。最常用的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，即在肉膏湯中加入510g/L的某一糖（醇、糖苷）和1.6%的溴甲酚紫指示劑，（同時(shí)在培養(yǎng)基中倒置一德拉姆氏管（Durham），高壓滅菌后備用。由于培養(yǎng)基正常的pH值為7.27.4,故此時(shí)培養(yǎng)基指示劑顯堿色（淡紫色）。3、方法：將被檢菌接種入糖（醇、糖苷）類發(fā)酵培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果。4、結(jié)果觀察：、培養(yǎng)基顏色不變（仍為淡紫色）， 則為陰性；用“

4、”表示。、培養(yǎng)基變黃，導(dǎo)管中無(wú)氣泡，為陽(yáng)性，但產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；用“+”表示。、培養(yǎng)基變黃，導(dǎo)管中有氣泡，為陽(yáng)性且產(chǎn)酸產(chǎn)氣；用“”表示。二、糖（醇、苷）類代謝類型試驗(yàn)這一類試驗(yàn)中，最典型的代表就是葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)（O/F）1、原理：細(xì)菌利用糖的方式有氧化和發(fā)酵兩種類型。其中在分解過程中必須由氧分子參加的為氧化型；能進(jìn)行無(wú)氧酵解的為發(fā)酵型，發(fā)酵型細(xì)菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧環(huán)境中都能分解葡萄糖。 不同細(xì)菌分解葡萄糖的能力不同，能分解葡萄糖的不同細(xì)菌，其分解方式也有所不同。O/F試驗(yàn)就是利用兩管同樣的含唯一一種可分解糖葡萄糖的培養(yǎng)基，一管處于有氧狀態(tài)；另一管造成厭氧環(huán)境，接種細(xì)菌并經(jīng)培養(yǎng)后，分別觀察細(xì)菌在有

5、氧和無(wú)氧環(huán)境中分解葡萄糖的能力，從而確定細(xì)菌對(duì)糖的分解類型的一類試驗(yàn)。2、培養(yǎng)基：通常所用的培養(yǎng)基是兩管含葡萄糖的半固體瓊脂，其中一管加有1ml的液體石蠟（隔絕空氣），稱“F管”；另一管不加石蠟，稱“O管”）。培養(yǎng)基中含有溴麝香草酚蘭（BTB Brom Thymol Blue）指示基。BTB在不同pH下的顏色變化為：酸性中性堿性 黃色 綠色 藍(lán)色由于培養(yǎng)基在正常狀態(tài)下呈中性，故正常狀態(tài)呈綠色。3、方法：用接種針挑取被檢菌，以穿刺接種法分別接種入“O”管和“F”管中，37培養(yǎng)1824小時(shí)，觀察結(jié)果：4、結(jié)果觀察： 5、意義：（1）、用于葡萄球菌屬與微球菌屬的 鑒別：（2）、用于腸桿菌科、弧菌科與

6、非發(fā)酵菌的鑒別。6、質(zhì)控菌株： “O”型：銅綠假單胞菌； “F”型：大腸埃希氏菌。三、葡萄糖代謝產(chǎn)物的測(cè)定這一類試驗(yàn)的典型代表是“甲基紅試驗(yàn)”（MR， Methylene Red）1、原理：不同的細(xì)菌分解葡萄糖后的代謝產(chǎn)物是不同的，如大腸埃希氏菌分解葡萄糖后產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再進(jìn)一步分解為甲、乙、丙、丁酸、乳酸、琥珀酸等各種酸類物質(zhì)，而使培養(yǎng)基的ph值下降，當(dāng)pH值下降至pH4.5以下時(shí)，加入甲基紅指示劑，培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色，此為陽(yáng)性反應(yīng)。 若細(xì)菌分解糖后產(chǎn)酸量較少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、酮、醛、氣體或水）培養(yǎng)基的pH值則保持在5.4以上，此時(shí)加入MR指示基，培養(yǎng)基呈桔黃色，此為陰

7、性反應(yīng)。因此，利用MR試驗(yàn)可測(cè)定細(xì)菌分解糖類后的代謝產(chǎn)物是酸類還是其它物質(zhì)，從而用于細(xì)菌的鑒別。 2、培養(yǎng)基和試劑： 葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水 MR指示劑3、方法：將被檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，37培養(yǎng)1824小時(shí)，加入MR指示劑23滴，立即觀察結(jié)果。4、結(jié)果觀察：培養(yǎng)基呈紅色者為陽(yáng)性； 桔黃色為陰性。5、意義：主要用于腸桿菌科各屬、種間的鑒別。6、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：大腸埃希氏菌； 陰性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌。四、葡萄糖分解途徑的測(cè)定(VP二氏試驗(yàn))1、原理：2、方法：、奧梅拉氏法（OMeara）：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，經(jīng)37孵育48小時(shí)后，按1ml培養(yǎng)基加0.1ml 40%KOH（含

8、0.3%肌酸或肌苷）溶液，置4850水浴中2小時(shí)或37孵箱4小時(shí)，充分搖動(dòng)，觀察結(jié)果。結(jié)果：出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性。、貝立脫氏法（Barritt）試劑：甲液：6%奈酚酒精溶液； 乙液：40%KOH溶液。方法：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，經(jīng)37，1824小時(shí)孵育后，按每毫升培養(yǎng)液加甲液1ml，乙液0.4ml，充分振搖，觀察結(jié)果。結(jié)果：如立即或于數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性；若為陰性，應(yīng)將試管置37，4h后再行觀察。（注：Barritt氏法比OMeara氏法敏感，故臨床較常用。）3、意義：主要用于腸桿菌科各屬、種間的鑒別。4、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌； 陰性菌株：大腸埃希氏菌。五、乳糖分解能力測(cè)定-

9、半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）1、原理：細(xì)菌分解乳糖需要兩種酶。半乳糖苷滲透酶：轉(zhuǎn)運(yùn)乳糖。-半乳糖苷酶：分解乳糖。有的細(xì)菌可產(chǎn)生-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚- -D-半乳糖苷（ONPG）, 從而生成黃色的鄰硝基酚。2、試劑：0.75M ONPG溶液：取ONPG 80mg溶于15ml蒸餾水中，再加入緩沖液5ml(6.9gNaH2PO4溶于45ml蒸餾水中，用30%NaOH調(diào)整pH為7.0,再加水至50ml)。置4 冰箱保存。ONPG溶液本身無(wú)色，如出現(xiàn)黃色則不宜再用。3、方法：取被檢菌1824h菌落，于0.25ml無(wú)菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖。將試管置37 水浴5分鐘，加入0.2

10、5mlONPG試劑，水浴20分鐘3小時(shí)，觀察結(jié)果。4、結(jié)果：菌懸液呈現(xiàn)黃色為陽(yáng)性反應(yīng)（一般在2030min內(nèi)顯色）。5、意義：本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。6、質(zhì)控菌：陽(yáng)性：大腸埃希氏菌 陰性：普通變形桿菌第二節(jié) 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸是細(xì)菌有機(jī)氮的來(lái)源，由于蛋白質(zhì)分子大，不能被細(xì)菌直接吸收利用，須先經(jīng)過胞外蛋白酶把蛋白質(zhì)分解成可以透過細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的多肽和氨基酸，即由于不同細(xì)菌對(duì)不同的蛋白質(zhì)和氨基酸的分解能力、代謝方式和代謝產(chǎn)物各不相同，故此類試驗(yàn)可作為鑒別細(xì)菌的重要指標(biāo)。一、靛基質(zhì)試驗(yàn)（Indol Test）1、原理：本試驗(yàn)主要是測(cè)定細(xì)菌能否產(chǎn)生色氨酸酶的一

11、種試驗(yàn)。有的細(xì)菌如大腸埃希氏菌能產(chǎn)生色氨酸酶，因而能分解培養(yǎng)基中的色氨酸產(chǎn)生吲哚（靛基質(zhì)），后者與試劑中的對(duì)位二甲氨基苯甲醛作用生成玫瑰靛基質(zhì)而顯紅色。2、培養(yǎng)基和試劑：培養(yǎng)基：蛋白胨水試劑：Ehrlich試劑： 對(duì)二甲氨基苯甲醛 1g， 無(wú)水乙醇 95ml, 濃鹽酸 20ml3、方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，3537培養(yǎng)1824h，沿試管壁輕輕加入Ehrlich試劑約0.5ml，使兩液之間形成一交界面，于交界面出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性。4、意義：主要用于腸桿菌科內(nèi)各屬、種的鑒別。5、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：大腸埃希氏菌；陰性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌。二、H2S試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如

12、胱氨酸、半胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇鉛或亞鐵離子，可形成黑色的硫化鉛和硫化亞鐵沉淀。2、培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。3、方法：將被檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中， 3537培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。4、結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性。5、意義：主要用于腸桿菌科的屬種鑒定。6、質(zhì)控菌：陽(yáng)性：普通變形桿菌 陰性：大腸埃希氏菌三、尿素分解試驗(yàn)1、原理：有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，能將培養(yǎng)基中的尿素分解產(chǎn)生大量的胺，從而使培養(yǎng)基變堿并使酚紅指示劑變紅。2、培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。3、方法：將被檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，3537培養(yǎng)1824h，觀察結(jié)果。4、結(jié)果：培養(yǎng)基變紅為陽(yáng)性，不變色為陰性5、意義：主要用于腸桿菌

13、科的屬種間鑒別。6、質(zhì)控菌：陽(yáng)性：普通變形桿菌 陰性：大腸埃希氏菌四、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)1、原理：有些細(xì)菌如變形桿菌屬可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基后生成苯丙酮酸，后者與三氯化鐵試劑作用，可形成一種不穩(wěn)定的綠色化合物。從而使苯丙氨酸斜面變?yōu)榫G色。2、培養(yǎng)基與試劑： 培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂斜面； 試劑：10%FeCL3溶液。3、方法：將試驗(yàn)菌大量接種于苯丙氨酸斜面上，37孵育1824小時(shí)；沿斜面滴加10%FeCL3試劑45滴，使其沿斜面上方流下，立即觀察結(jié)果，斜面出現(xiàn)綠色者為陽(yáng)性。4、注意事項(xiàng)：結(jié)果必須立即觀察，若延長(zhǎng)時(shí)間，則綠色會(huì)消退。5、用途：主要用于腸桿菌科的初步分群。6、質(zhì)控菌：

14、陽(yáng)性菌株：普通變形桿菌；陰性菌株：大腸埃希氏菌。五、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)1、原理：本試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌能否產(chǎn)生氨基酸脫羧酶以及氨基酸脫羧酶種類的一種試驗(yàn)。臨床上常用的氨基酸脫羧酶試驗(yàn)共有三種：即賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)和精氨酸脫羧酶試驗(yàn)。各種細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的種類雖不盡相同，但氨基酸發(fā)生脫羧基反應(yīng)后的產(chǎn)物卻是基本相同的，即都產(chǎn)生胺和CO2。如：由于胺是堿性物質(zhì)，大量胺的產(chǎn)生使培養(yǎng)基的Ph值升高（7.0以上），從而使培養(yǎng)基中的溴甲酚紫指示劑顯紫色。2、培養(yǎng)基：試驗(yàn)管：含0.1%葡萄糖；0.5%相應(yīng)氨基酸；溴甲酚紫指示劑。對(duì)照管：除不含相應(yīng)的氨基酸外，余均同試驗(yàn)管。 兩管均應(yīng)加入液體石蠟或礦

15、物油，以隔絕空氣。3、方法：將試驗(yàn)菌分別接種于氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，3537培養(yǎng)14天（此時(shí)細(xì)菌首先分解葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基變黃；再使氨基酸脫羧產(chǎn)生胺，由于培養(yǎng)基中氨基酸的含量是葡萄糖含量的五倍，故產(chǎn)堿量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)酸量，因此陽(yáng)性者最終指示劑顯堿色），觀察結(jié)果。4、結(jié)果觀察：5、意義：主要用于腸桿菌科的屬、種鑒定。6、質(zhì)控菌株： 第三節(jié) 有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)一、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（Citrate Test）1、原理：本試驗(yàn)就是測(cè)定細(xì)菌能否利用枸櫞酸鹽作為唯一的碳源和能否利用磷酸二氫銨做為唯一氮源的一種試驗(yàn)。當(dāng)把細(xì)菌接種到只含有枸櫞酸鹽和磷酸二氫銨這種唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基中時(shí)，若細(xì)菌

16、不能利用這種唯一的碳源和氮源，則細(xì)菌不能生長(zhǎng)；若細(xì)菌能以此作為唯一的碳、氮源，則能利用其生長(zhǎng)繁殖，并將枸櫞酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)樘妓猁}，同時(shí)將磷酸二氫銨分解成磷酸鹽和NH3。由于碳酸鹽和NH3均屬堿性，故大量產(chǎn)生后可使培養(yǎng)基變堿，使溴麝香草酚蘭指示劑變藍(lán)色。 2、培養(yǎng)基：西蒙氏枸櫞酸鹽斜面培養(yǎng)基3、方法和結(jié)果：將被檢菌大量接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，3537培養(yǎng)1824小時(shí)后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基斜面由綠色變?yōu)樗{(lán)色，則為陽(yáng)性；若培養(yǎng)基斜面仍為綠色為陰性。 4、質(zhì)控菌株：陽(yáng)性：產(chǎn)氣腸桿菌； 陰性：大腸埃希氏菌。5、意義：主要用于腸桿菌科的屬、種鑒別。二、葡萄糖酸鹽利用試驗(yàn)1、原理：該試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌在生長(zhǎng)繁

17、殖過程中能否利用葡萄糖酸鹽作為唯一碳源的一種試驗(yàn)。有些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，能利用葡萄糖酸鹽作為唯一碳源，因此能將葡鹽分解，生成酮基葡萄糖酸，后者具有較強(qiáng)的還原性，在高溫環(huán)境中，可將蘭色的班氏硫酸銅（或可溶性氫氧化銅）中的二價(jià)銅離子還原成棕紅色不溶性的氧化亞銅沉淀。2、培養(yǎng)基和試劑：培養(yǎng)基：葡萄糖酸鹽蛋白胨肉湯 蛋白胨 1.5g 酵母浸膏 1g 磷酸氫二鉀 1g葡萄糖酸鉀 40g蒸餾水 1000ml上述成分加熱溶解、過濾，每支試管分裝2ml；15磅15分鐘高壓滅菌后備用。試劑：班氏（Benedict）硫酸銅試劑。3、方法和結(jié)果：直接加1ml班氏（Benedict）硫酸銅試劑于經(jīng)1824小時(shí)培養(yǎng)的葡

18、鹽菌液中，充分搖勻，置沸水浴中10分鐘，試管中產(chǎn)生棕紅色沉淀者為陽(yáng)性。4、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌； 陰性菌株：大腸埃希氏菌。5、意義：用于腸桿菌科的初步分群。第四節(jié) 呼吸酶類及其它酶類試驗(yàn)一、氧化酶試驗(yàn) （Kovac氏法）1、原理：氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。它可使鹽酸二甲基（或四甲基）對(duì)苯二胺氧化而產(chǎn)生顏色反應(yīng)，生成一種叫做Wurster氏藍(lán)的紫黑色物質(zhì)。實(shí)際上，在做氧化酶試驗(yàn)時(shí)，氧化酶并不能直接與氧化酶試劑（1%鹽酸二甲基或四甲基對(duì)苯二胺）發(fā)生反應(yīng)，而是首先使還原型的細(xì)胞色素C氧化成氧化型的細(xì)胞色素C；后者再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。因此，該試驗(yàn)的

19、結(jié)果又與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。2、試劑：1%鹽酸二甲基（四甲基）對(duì)苯二胺 （避光保存）3、方法及結(jié)果：取一潔凈濾紙片，沾取被檢菌的菌落少許，加氧化酶試劑一滴，陽(yáng)性者立即呈粉紅色，繼而變?yōu)樯罴t色，并于1030分鐘內(nèi)變?yōu)樽虾谏?；陰性者顏色無(wú)明顯改變。4、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：銅綠假單胞菌：陰性菌株：大腸埃希氏菌。5、意義：（1）、用于奈瑟氏菌屬的鑒定（均陽(yáng)性）。 （2）、用于腸桿菌科與其它相似菌科的鑒別。6、注意事項(xiàng)：（1）、操作過程中應(yīng)避免接觸含鐵物質(zhì)，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性；（2）、若菌落本身呈紅色，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)法判斷時(shí)，可于試驗(yàn)時(shí)在紙片上滴加氧化酶試劑后，再滴加一滴10%萘酚，此時(shí)菌落變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性；菌

20、落仍為紅色為陰性。其原理為：二、觸酶試驗(yàn)1、 原理：該試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌是否具有過氧化氫酶的一種試驗(yàn)。有的細(xì)菌如微球菌科能產(chǎn)生過氧化氫酶，該酶能使過氧化氫分解產(chǎn)生新生態(tài)氧，繼而形成氧分子逸出試劑而產(chǎn)生氣泡。 觸酶H2O2 H2O + O O2 2、試劑：3% H2O23、方法：在一潔凈載物玻片或平皿蓋上滴加一滴3% H2O2，用接種環(huán)或接種針挑取被檢菌菌落少許，置于3% H2O2中，觀察結(jié)果。于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性；無(wú)氣泡產(chǎn)生著為陰性。4、意義：主要用于微球菌科與鏈球菌科的鑒別。5、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：金黃色葡萄球菌；陰性菌株：草綠色鏈球菌。6、注意事項(xiàng)：、不得使用血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落，因

21、紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白上的鐵離子也有觸酶作用，可出現(xiàn)假陽(yáng)性。、盡量使用新鮮菌落，因陳舊培養(yǎng)物易喪失觸酶，造成假陰性。三、DNA酶試驗(yàn) 2、培養(yǎng)基和試劑： 培養(yǎng)基：DNA瓊脂培養(yǎng)基；試劑：1N HCL。3、方法和結(jié)果：將受試菌點(diǎn)種在DNA瓊脂平板上，37孵育1824h，滴加1N HCL使覆蓋平板表面，于菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)者為陽(yáng)性。4、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：金黃色葡萄球菌；陰性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌。5、意義：、用于金黃色葡萄球菌的鑒別；、用于腸桿菌科某些屬種的鑒別。注：微量反應(yīng)管檢測(cè)DNA酶原理在肉湯培養(yǎng)基中加入DNA酶和甲基綠（MG），MG可與長(zhǎng)鏈的DNA結(jié)合，形成一種綠色聚合物，故培養(yǎng)基本身呈綠色。當(dāng)細(xì)菌生

22、長(zhǎng)后，若能產(chǎn)生DNA酶，則DNA多核苷酸長(zhǎng)鏈被水解成寡核苷酸短鏈，MG不能與寡核苷酸短鏈聚合而被游離。游離的MG由綠色變?yōu)闊o(wú)色。故試驗(yàn)中培養(yǎng)基由綠色變?yōu)榛野咨珵殛?yáng)性。如圖所示：四、血漿凝固酶試驗(yàn)1、原理：有些細(xì)菌如金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)繁殖過程中可產(chǎn)生血漿凝固酶。該酶分為兩種，一種由細(xì)菌產(chǎn)生后，不分泌到菌體外，而是結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞壁上，此類凝固酶又稱結(jié)合凝固酶或固定凝固酶，也叫凝聚因子。凝聚因子是一種真正的凝固酶，它可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，后者附著在菌細(xì)胞表面，從而使細(xì)菌凝聚成團(tuán)。玻片法凝固酶試驗(yàn)檢測(cè)的即是凝聚因子。 凝聚因子 纖維蛋白原 纖維蛋白另一種凝固酶由細(xì)菌產(chǎn)生后分泌到菌體外

23、。此類凝固酶稱游離（分泌型）凝固酶。實(shí)際上，這類凝固酶并非是真正的凝固酶，而是一類凝固酶原樣物質(zhì)，它必須在血漿中的凝固酶致活因子（如Ca+）的激活下才能轉(zhuǎn)變?yōu)槟堂笜游镔|(zhì)，然后才能使血漿凝固。 凝固酶致活因子（Ca+） 凝固酶原樣物質(zhì) 凝固酶樣物質(zhì) 纖維蛋白原纖維蛋白試管法凝固酶試驗(yàn)檢測(cè)的即是游離凝固酶。 2、方法：（1）、玻片法：在一潔凈載玻片上滴加一滴生理鹽水，用接種環(huán)挑取受試菌的菌落，乳化在生理鹽水中，經(jīng)1020秒確認(rèn)無(wú)自凝后，挑取兔或人血漿一環(huán)，混合在乳化菌液中，10秒鐘內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性。（2）、試管法： 、取小試管三支，分別標(biāo)以陽(yáng)性（P）、試驗(yàn)（T）和陰性（N）字樣。、其余操作見下

24、表。 3、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：金黃色葡萄球菌；陰性菌株：表皮葡萄球菌。4、意義：用于葡萄球菌屬的鑒定。5、注意：（1）、金葡菌不是唯一能產(chǎn)生血漿凝固酶的細(xì)菌。（2）、能產(chǎn)生血漿凝固酶的細(xì)菌并非都能同時(shí)產(chǎn)生兩種凝固酶。五、 膽鹽溶菌試驗(yàn)1、原理：本試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌能否被膽汁或膽鹽溶解的一種試驗(yàn)。有些細(xì)菌如肺炎鏈球菌能被膽汁或膽鹽裂解。膽鹽溶菌的原理目前尚不完全明了，但多數(shù)人認(rèn)為溶菌的機(jī)理有二：一是膽汁（鹽）能降低細(xì)菌的表面張力，從而促進(jìn)細(xì)菌的裂解；二是膽鹽能促進(jìn)細(xì)菌自溶酶的活性，從而加速細(xì)菌的自溶。3、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：肺炎鏈球菌；陰性菌株：草綠色鏈球菌。 4、意義：（1）、用于肺炎鏈球菌與其它甲型

25、溶血性鏈球菌的鑒別；（2）、用于致病性奈瑟氏菌（腦膜炎奈瑟氏菌）的鑒別。5、注意：（1）、做此試驗(yàn)必須用活菌，膽鹽對(duì)死菌無(wú)裂解作用。 （2）、去氧膽酸鈉在酸性環(huán)境下易發(fā)生沉淀而成膠胨狀，故當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)液呈膠胨狀時(shí)，應(yīng)先將其pH值調(diào)至弱堿性再行試驗(yàn)。六、CAMP試驗(yàn)1、原理：該試驗(yàn)是測(cè)定細(xì)菌能否產(chǎn)生CAMP因子的一種試驗(yàn)。CAMP因子是一種促溶血因子，它能促進(jìn)葡萄球菌產(chǎn)生的溶血素的溶血活性，從而在兩菌交界處產(chǎn)生擴(kuò)大的矢狀溶血區(qū)。由于CAMP因子是由Christian、Atkins、MounchPeterson等人共同發(fā)現(xiàn)的，故稱CAMP因子。2、方法：取血平板一個(gè)，先將呈溶血的金葡菌用接種環(huán)在平皿

26、中央或偏下畫一橫直的接種線，然后再挑取被檢菌，在其垂直的位置畫一垂線，兩線不能相交，應(yīng)相距3mm。置371824小時(shí)，取出后觀察結(jié)果。若兩菌交界處出現(xiàn)矢狀溶血區(qū)為陽(yáng)性。3、質(zhì)控菌：陽(yáng)性菌株：B群鏈球菌；陰性菌株：其它群鏈球菌。4、意義：主要用于B群鏈球菌和其它群鏈球菌的鑒別。5、注意：每次最好能以陰、陽(yáng)性菌株做對(duì)照。硝酸鹽還原試驗(yàn)1、原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過程。其一是在合成代謝中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮物質(zhì)；另一是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。 硝酸鹽還原的過程可因細(xì)菌種類的不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞

27、硝酸鹽，如大腸埃希氏菌等；有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌可使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷氏菌屬；有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽如果還原生成氣體的終末代謝產(chǎn)物如氮或氧化氮，稱為脫硝化作用。 2、試劑：甲液：對(duì)氨基苯磺酸 0.8g；5N醋酸100ml。乙液：-萘胺0.5g；5N醋酸100ml。用時(shí)將甲液和乙液等量混合。 3、方法和結(jié)果：接種待檢菌于硝酸鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14天，加入硝酸鹽試劑0.1ml,觀察結(jié)果。立即或于10分鐘顯紅色者為陽(yáng)性。如欲觀察有無(wú)氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培養(yǎng)基內(nèi)加一只小倒管，若有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮?dú)馍伞?4、注意：本試驗(yàn)的陰性反應(yīng)有三種原因：一為細(xì)菌不能還原硝酸鹽；二為亞硝酸鹽繼續(xù)分解生成氨和氮；三為培養(yǎng)基不適于細(xì)菌生長(zhǎng)。 如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否被還原，可取鋅粉少許加入培養(yǎng)基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽仍存在；如不出現(xiàn)紅