重大科學研究計劃2011年立項項目70份標書2012cb

1、項目名稱：納米界面生物分子作用機制的基礎研究及其列早期檢測中的應用首席科學家：中國應用物理研究所起止年限：2012.1 至 2016.8依托部門：市科委中國一、關鍵科學問題及研究內容本項目擬解決的關鍵科學問題如下：（1）如何設計生物傳感界面并揭示納米界面上生物分子作用機制生物檢測的關鍵步驟之一是在界面上通過抗體、DNA等識別分子實現(xiàn)對靶標分子的捕獲。這一過程中涉及多種分子在納米界面上的協(xié)同作用，在這個界面生物分子識別的效率是實現(xiàn)生物檢測的基礎。一方面，生物分子在常規(guī)界面上容易產生非特異性吸附，這往往是影響生物傳感器性能的重要和假陽性的重要來源，因此，如何通過合理設計納米結構來構筑高特異性和高效

2、生物反應的界面并實現(xiàn)生物識別分子的精確組裝是本項目成功的關鍵。另一方面，組裝在納米材料界面上的生物分子需要保持其生理活性以充分發(fā)揮其功能（如特異性高效識別），因此生物分子在納米界面的可控高效率偶聯(lián)也是納米生物檢測技術中的一個關鍵問題。將物傳感過程中的電荷轉移、能量轉移以及電子耦合機制，通過自組裝參數(shù)的改變，揭示界面生物分子組裝的機理及生物傳感檢測性能之間的關系并在此基礎上實現(xiàn)優(yōu)化。而通過界面親疏水性和電荷密度及其分布的調控以及導入外力場的作用將有可能實現(xiàn)防止蛋白質非特異性吸附，可以在不同體液介質中通用的納米界面。（2）如何實現(xiàn)生物檢測中的有效信號轉換及放大過程的光、電調控 生物檢測的基本原理是

3、將分子識別的行為（如抗體-抗原的結合）轉化為各種物理或化學信號，該信號可以被傳送到某一檢測技術的信號收集，并通過各種相應的物理化學過程將信號進一步放大以提高檢測靈敏度。由于生物分子對環(huán)境因子非常敏感，不同分子發(fā)揮其最佳功能所需要的環(huán)境條件是不一樣的，而在信號級聯(lián)放大過程中又需要將若干分子集成在一起，且在相同環(huán)境條件下發(fā)揮作用。因此，如何有效實現(xiàn)納米生物檢測中信號的高效、可靠、可重復的轉換，并將信號有效地放大是提高生物傳感器的檢測可靠性、準確性與靈敏度的關鍵。針對這一問題，設計與生物分子相容性好的納米材料，并通過系統(tǒng)研究多種納米材料和納米結構的與修飾方法，實現(xiàn)納米材料的生長尺寸和粒徑分布的精確控

4、制，并通過化學和物理方法對其進行剪裁、修飾、分散以及表面改性。通過考慮熱力學和動力學，在實驗中選擇合適的生物分子組合，實現(xiàn)納米材料與生物分子耦合，形成穩(wěn)定、均一和高效的納米生物探針用于生物檢測信號的放大。同時通過調節(jié)環(huán)境因子（如，離子強度等）使得不同生物分子發(fā)揮最佳的協(xié)同作用。（3）如何通過腫瘤標志物聯(lián)合檢測來提高癌檢測的特異性 臨床醫(yī)學研究表明，由于成因和發(fā)生、發(fā)展的復雜性，通過單一靶標分子的檢測來實現(xiàn)的確診幾乎是不可能的；同時，各個已被發(fā)現(xiàn)的腫瘤分子標志物與腫瘤發(fā)生之間的關聯(lián)性各有不同，目前也缺乏的標準和定論。因此，如何充分發(fā)掘已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關的靶標分子的潛力，通過多個分子水平的多指標聯(lián)

5、合檢測，將得到的大量數(shù)據(jù)建模分析，有望能對各個腫瘤標志物與特定發(fā)生發(fā)展過程之間的響應性和相關性進行研究評價，并在此基礎上通過多指標聯(lián)合檢測將早期檢測的準確度，有效降低現(xiàn)有單一檢測中假陽性與假率過高。 對于癌，以成PSA檢測為基礎，通過蛋白質、DNA、RNA和小分子代謝物等四個分子水平的多環(huán)節(jié)、多指標聯(lián)合檢測來判斷這些標志物對于判斷癌發(fā)生和發(fā)展的響應性以及多個標志物之間的相互關聯(lián)情況。同時，通過多指標的數(shù)據(jù)分析建立一套癌早期檢測的新方法，提高基于PSA篩查的癌準確性，降低假陽性與假概率，既不漏查假，也可最大限度地使假陽性患者避免穿刺活檢的痛苦。圍繞以上關鍵科學問題本項目將進行以下研究：1. 界面

6、納米結構的構筑與生物分子作用機制的基礎研究系統(tǒng)研究蛋白質、核酸等生物大分子在納米粒子界面上（納米探針界面）和界面納米結構上（傳感界面）進行組裝的過程中的物理化學特性，深入了解生物分子界面組裝和識別過程及其機制，從而為提高生物檢測的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性和響應速度等主要性能指標提供指導。1.1 納米探針界面與傳感界面納米結構的設計與一系列高質量的功能納米材料，并實現(xiàn)其可控生長和粒徑可調；在金、碳或硅基底表面構筑精細納米結構，并建立一套簡便、重復性好的界面納米結構構筑的工藝流程。通過表面修飾與改性，賦予這些納米界面良好的水溶性、化學穩(wěn)定性與生物相容性。1.2 納米界面上生物分子的理化機制研究從空間

7、、能量、時間三個方面來對生物分子在納米界面上的時空行為和動態(tài)結構進行高分辨、表征，并進一步通過對特定分子功能團進行選擇性剪裁和修飾，實現(xiàn)對納米界面上生物分子的結構和功能的調控。通過利用光、電、磁外場的影響，研究該納米生物體系中的結構變化、電子電荷輸運、光電轉換的問題以及相關的原理。 通過對生物分子在納米界面上的固定化（組裝）過程、分子識別過程、穩(wěn)定性和可再生性的系統(tǒng)研究，形成對生物傳感界面的完整認識并探索出一套系統(tǒng)、可行的組裝方法，并獲得納米界面上的擴散、對流和生物反應的基本圖景。1.3 多元、協(xié)同納米界面的構筑在深入理解界面生物分子作用機制的基礎上，通過化學鍵合或分子自組裝技術實現(xiàn)生物識別分

8、子（如抗體、DNA、核酸適配體等）在納米探針界面上的偶聯(lián)，以設計具有選擇性識別特定分子靶標的能力的納米生物探針。 通過精確控制多種生物分子在其表面不同區(qū)域的組裝，設計并構筑一個在局域空間內可協(xié)同發(fā)揮多功能的多元、協(xié)同納米界面。在這一界面上，通過親疏水性和電荷密度的調控防止雜質吸附和背景干擾，以實現(xiàn)靶標分子的高特異性捕獲與識別；通過納米材料的光電效應將生物識別過程有效轉換成光或電信號，并納米結構表面的級聯(lián)放大實現(xiàn)信號倍增以提高檢測靈敏度。2. 基于多元、協(xié)同界面的電化學納米生物傳感器研究設計并具有多元、協(xié)同傳感界面的電化學電極，提高電化學傳感器的靈敏度與特異性，發(fā)展手持式的便攜、靈敏、快速、廉價

9、的電化學納米生物傳感裝臵，實現(xiàn)對PSA的快速靈敏檢測，用以滿足癌大規(guī)模低成本篩查及癌術后的預后評價與監(jiān)測的要求。2.1設計電化學電極的多元協(xié)同傳感界面，PSA抗原響應性電極利用生物識別原理，綜合運用各種技術如自組裝、原位沉積、物理、化學修飾及電化學處理等傳感界面固定化方法，在電極和電極陣列界面上構建納米結構。通過，將特異性捕獲探針（對PSA特異性識別的抗體或抗體片段）組裝在具生物相容性的納米界面上，對PSA抗原有特異性響應的生物敏感膜修飾電極。研究多元協(xié)同納米界面的設計與優(yōu)化，通過測定探針分子的負載量、空間取向與識別量的關系等來標定界面特性及修飾效果。納米結構有助于使捕獲探針保持高效的配體識別

10、性能，并提高其穩(wěn)定性。2.2研制基于電化學傳感技術的PSA檢測利用生物識別原理和光、電、磁等對界面行為的影響，發(fā)展基于能量轉移的新原理和信號傳導與放大的新方法，實現(xiàn)生物識別信號的放大以增加信噪比，提度。采用微電子光刻和化學鍍等技術，設計與各種類型的陣列式傳感基片，并設計相應配套的微流體通道及檢測裝臵，提供集成式的陣列微流體傳感分析系統(tǒng)。研制能夠自動過濾干擾物質的樣品檢測傳感探頭與傳感器的信號檢測與數(shù)據(jù)分析模塊，構建針對PSA標志物的集成化和程序化的微電化學傳感檢測。 2.3電化學納米生物傳感器的綜合評價 通過調試以及樣品測試條件的選擇使電化學納米生物傳感器的綜合性能指標誤差控制在合理范圍以內。

11、將該傳感器初步應用于及唾液、尿液和液等其它體液樣本中的PSA檢測，通過對靈敏度、特異性、準確度、穩(wěn)定性、相關性等生物檢測技術指標的分析，綜合評價所構建的多通道便攜式電化學生物傳感在多種復雜生物體系中的功能，驗證其在實際生物體系探測中的實用價值。3基于多元、協(xié)同界面的癌標志物的納米生物檢測方法研究建立基于時間分辨熒光和共軛高分子探針的檢測系統(tǒng)，發(fā)展針對PSA及其它新型蛋白靶標、水平的甲基化靶標、microRNA靶標和小分子代謝物靶標等四個水平的多種指標的生物分析方法，為利用多指標聯(lián)合檢測來有效降低PSA篩查中的假陽性率提供技術。3.1 建立基于時間分辨熒光檢測的蛋白質和小分子檢測系統(tǒng)建立及優(yōu)化基

12、于時間分辨熒光技術的檢測。通過多元協(xié)同界面納米提高抗體探針在界面的識別捕獲效率，并利用課題一設計的稀土（Eu)納米信號探針激發(fā)產生高強度的時間分辨熒光，從而顯著提高靶標的檢測靈敏度。3.2 建立基于核酸擴增和水溶性共軛聚合物信號放大的核酸檢測系統(tǒng)利用水溶性共軛聚合物納米探針的高效熒光信號放大作用，將核酸擴增、熒光能量轉移（FRET）相結合，檢測癌相關的DNA甲基化和中microRNA靶標含量。通過對癌發(fā)生及早期發(fā)展過程中變化分析，研究多個與癌的累積疊加效應，發(fā)展具有高特異性、度的癌早期技術。 3.3 新型癌納米檢測技術的性能評價對課題中建立的多種癌檢測方法進行性能評估。主要指標包括：準確度、精

13、密度、線性范圍、最低檢測限（分析靈敏度）、特異性、高濃度Hook效應及樣本稀釋、參考值（范圍）確定和試劑穩(wěn)定性研究等。4癌納米檢測技術在篩查與驗證中的應用研究對于建立的疾病檢測方法，必須利用實際樣本進行檢驗后才能判斷其臨床價值。擬建立并完善癌生物樣本庫與數(shù)據(jù)庫，并用于評價本項目建立的PSA電化學傳感器列和治療中的臨床價值。結合本項目發(fā)展的基于多元協(xié)同界面的多種癌靶標檢測方法，篩選出針對癌的“最佳腫瘤標志群”，建立多指標聯(lián)用模型并進行評價。癌臨床病例選擇及生物樣本庫的建立4.1建立包括癌組癌術后組和良性疾病組（增生等）在內的數(shù)據(jù)庫，支持提取與信息共享。各組病例要求不小于300例，具備完整臨床資料

14、和隨訪情況。提取相關的外周血樣本、液與組織，建立相關的生物樣本庫。4.2 電化學納米生物傳感器的臨床前研究對發(fā)展的基于PSA靶標的電化學生物傳感器進行臨床價值評估，評價其列早期發(fā)現(xiàn)和篩查、鑒別與分期、預后判斷、療效監(jiān)測和復發(fā)等應用中的實際價值。重點評估PSA電化學生物傳感器的檢測時間、方便程度，并進行經(jīng)濟學評價。4.3 多指標聯(lián)用模型的構建及評估利用建立的癌生物樣本庫，使用基于多元協(xié)同界面的納米生物檢測系統(tǒng)對相關靶標分子進行檢測。將得到的大量數(shù)據(jù)進行建模分析，研究這些不同靶標分子對于判斷癌發(fā)生和發(fā)展的響應性以及多個靶標分子之間的相互關聯(lián)情況。應用粗糙集歸類、遺傳算法、遞歸特征消除等算法，選擇影

15、響癌的主要特征。同時結合支持向量機、隨機森林、網(wǎng)絡等機器學習算法以及一致性模型，建立多指標聯(lián)用的癌模型，根據(jù)建立的模型對癌進行以及對可能出現(xiàn)癌的幾率做出評估。重點多指標聯(lián)用的癌模型的特異性指標，是否有效降低了假陽性。二、預期目標總體目標：基于新興的納米技術和生物技術，以癌為研究對象，發(fā)展針對癌各種靶標的生物傳感新技術和新方法?？傮w而言，本項目擬在深入研究納米尺度界面上生物分子吸附、組裝和折疊的基本物理化學原理的基礎上，通過多元、協(xié)同納米界面的設計與構筑提高生物檢測方法的能力、靈敏度以及特異性，從而大幅度提高我國納米生物檢測技術的創(chuàng)新能力和應用水平。具體而言，期望研制“器件化”的便攜、靈敏、快速

16、、廉價的電化學納米生物傳感器件，用以滿足癌大規(guī)模低成本篩查及癌術后的預后評價與監(jiān)測的要求；發(fā)展針對多種不同靶標的納米生物檢測系統(tǒng)，并應用生物信息學的方法研癌的響應性,建立多指標聯(lián)用的準確性。同時，建立與完善大規(guī)模的究這些不同靶標分子對于型，從而顯著提高臨床 本與數(shù)據(jù)庫，并對發(fā)展的癌模癌生物樣癌早期檢測技術進行臨床驗證。期望通過本項目的研究，能夠列的早期檢測及預后方面發(fā)揮作用，為在我國建立前列的普查機制、癌早期診治能力貢獻力量。五年預期目標：以多元、協(xié)同納米界面的設計與構筑為，發(fā)展多種針對不同靶標的納米檢測新技術和新方法，突破癌早期診治特異性及靈敏度方面的世界性難題，為癌的早期檢測及預后提供先進

17、。1）通過深入研究納米尺度界面上生物分子吸附、組裝和折疊過程，揭示其中的基本物理化學原理，設計并構筑在局域空間內可協(xié)同發(fā)揮多功能的多元、協(xié)同納米界面，以顯著提高生物傳感器的能力、靈敏度以及特異性。2）設計并具有多元、協(xié)同傳感界面的電化學電極，發(fā)展具有知識的、針對PSA和fPSA靶標的便攜式電化學納米傳感器，實現(xiàn)對PSA/fPSA的簡便、快速、廉價檢測?？赏瑫r實現(xiàn) 16或96通道篩查，檢測限優(yōu)于平，檢測時間在1小時內完成。(ng)水3）發(fā)展針對蛋白靶標、水平的甲基化靶標、microRNA靶標和小分子代謝物靶標等多個水平、多種指標的納米生物檢測方法。對蛋白、DNA和RNA靶(pg)水平；小分子優(yōu)于

18、微克(g)水平。癌樣本庫，對研制的便攜式電化學納米傳感器進行臨床前評標的檢測限優(yōu)于4）建立估，病例數(shù)不低于300例。結合發(fā)展的面向多種靶標的納米檢測方法與臨床病例，使用生物信息學方法研究這些靶標分子對于癌的響應性，建立癌多指標聯(lián)用模型，并進行評估。5）在納米與醫(yī)學的交叉領域做出一批國際先進水平的SCI成果，100篇以上，其中50篇以上在各相關領域的上；申請中國發(fā)明專利10-15項，專利1-2項。三、研究方案1）學術思路 以多元、協(xié)同納米界面的構筑為，發(fā)展針對不同靶標的納米生物檢測方法，并研制兩套具有不同特征與功能的納米器件（廉價的電化學生物傳感器；高特異性的多指標聯(lián)合檢測系統(tǒng)），致力于癌的早期

19、檢測水平。具體而言：一個目標：癌的早期檢測水平；兩個器件：快速、便攜、廉價的電化學生物傳感器；、高特異性的多指標聯(lián)合檢測系統(tǒng)；多種方法：針對PSA篩查電化學檢測；針對多種蛋白靶標的時間分辨熒光檢測，針對DNA甲基化與microRNA 的共軛聚合物熒光檢測方法和針對小分子代謝物靶標的核酸適配體熒光檢測；基礎：多元、協(xié)同納米界面的構筑組裝和識別過程的清晰圖景，并建立其與生物傳感性能之間的聯(lián)系。1.1納米探針界面與傳感界面納米結構的設計與擬通過條件的控制以得到一系列尺寸可控、水溶性及單分散性好的納米材料，并優(yōu)化材料的各種物理化學性能。其中碳納米管將直接使用商業(yè)產品，其它材料的方法如下：1）采用水相超

20、聲輔助的途徑，得到尺寸控制更為準確單一、發(fā)射峰且波長可調、并具備更強發(fā)光效率的II-IV族量子點納米材料；2）通過氯金酸水相還原和晶種誘導生長的方備各種直徑的金納米粒子和不同長徑比的金納米棒，并具備從可見光到近紅外光（520-900 nm）的等離子體吸收性能；3）采用二甲基硅烷水解備Eu摻雜二氧化硅納米顆粒，或通過溶劑熱方備含Eu的稀土氧化物/氟化物納米晶（包括Y2O3:Eu、NaYF4:Eu），具備尺寸小、均一性好、且具有高熒光量子產率和長熒光等特性；4）設計不同親/疏水性質的共軛聚合物嵌段，通過尺寸形貌調控獲得高發(fā)光強度、長發(fā)光的共軛聚合物納米材料（納米粒子和納米棒）。在金、碳或硅基底表面

21、通過化學刻蝕、納米材料嫁接或電化學原位可控生長等方面構筑精細納米結構，主要包括納米粒子輔助的硝酸或化物刻蝕技術來有序的納米線陣列或圖案；通過將化學的納米金材料通過沉積或化學鍵合等方法固定在基底上形成復合納米結構；通過電位精確控制金屬在基底上的還原和可控生長，獲得尺寸均一、晶面可控納米粒子或具有精細結構的納米花等。并通過工藝控制建立一套簡便而又重復好的界面納米結構構筑流程。對材料的表面有針對性地通過親水基團的引入或兩親高分子（如PEG修飾的磷脂）包覆進行修飾和改性，以增強其水溶性和在生理溶液如、尿液等中的穩(wěn)定性（無團聚沉淀）。同時，為了減少檢測的背景和噪聲，盡可能降低納米材料表面對生物分子和其他

22、界面的非特異性吸附。1.2 納米界面上生物分子理化機制研究系統(tǒng)物分子在溶液態(tài)的和連接在納米界面后的熱力學以及構象變化，并且對兩者物理化學性質進行比較。擬利用同步輻射（小角散射SAXS、近邊吸收譜NEXAFS等）、多種穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)光譜、電化學、原子力顯微鏡、表面表征技術（如橢圓偏振、石英晶體微天平、表面等離子體分析儀）等一系列先進分析技術系統(tǒng)來物分子在納米界面的物理化學過程。如應用石英晶體微天平（QCM）和表面等離子（SPR）來測量生物分子在界面的結構變化；通過光譜和電化學方法檢測生物分子的表面密度；通過時間分辨熒光及電化學方法來研究生物分子在界面折疊的動力學過程；通過NEXAFS研究界面生物分子

23、的取向；通過SAXS研究納米界面的生物分子構象等。 通過上述研究，系統(tǒng)研究特定修飾的界面對生物分子折疊能的影響，以及這些作用怎樣通過改變界面環(huán)境（組裝密度、表面電荷等）來調節(jié)；通過測量生物分子在界面的構象變化，增強對探針和界面組裝如何影響其動力學過程的理解；探索界面誘導效應，揭示相關的熱力學原理以深入了解生物分子在界面的構象變化，并基于構象信息在熱力學和動力學上來提高生物分子識別能力；研究在光、電、磁等外場影響下，納米界面上生物分子的構象變化以及如何調控電子電荷輸運及光電轉換等。1.3 多元、協(xié)同納米界面的構筑 通過系統(tǒng)研究界面納米結構與生物分子之間的相互作用，了解生物分子在不同界面上的構型及

24、排列情況，以及在界面上的吸附、凝聚與擴散等特性，利用對界面納米結構修飾的化學基團、間隔基的長度、間隔基及（如寡聚乙二醇等）來精確控制多種生物分子在其表面不同區(qū)域的組裝，設計并構筑一個在局域空間內可協(xié)同發(fā)揮多功能的多元、協(xié)同納米界面。通過研究界面上的電荷轉移、能量轉移以及電子耦合機制，并通過自組裝參數(shù)的改變，以揭示界面組裝機制，深入了解多元協(xié)同界面上的功能集成效應、功能融合效應，功能調控效應等。為了使納米探針具有特異性識別待檢測癌靶標分子的能力，需要將不同種類的納米材料通過表面特定功能團與能識別癌靶標的生物分子進行可控的分子鍵偶聯(lián)。根據(jù)待檢測物的不同，偶聯(lián)的生物分子將包括蛋白和核酸兩大類。其中P

25、SA和其他癌相關蛋白的檢測主要通過抗體對PSA和這些蛋白分子的特異性識別來實現(xiàn)；microRNA的檢測主要通過具有互補序列的核酸鏈的雜交配對來實現(xiàn)；小分子肌氨酸則通過核酸適配體對其的特異性結合得以實現(xiàn)。偶聯(lián)的化學方法主要利用納米材料表面上功能基團如羧基和氨基，在偶聯(lián)試劑作用下與生物分子的氨基、羧基或巰基偶聯(lián)。利用這些偶聯(lián)技術，構建用于針對癌靶標分子檢測的具有超靈敏度和特異識別能力的納米生物探針。偶聯(lián)反應過程中需要保持生物分子的特異性識別功能；構建的探針產物需要進行嚴格純化和分析；得到的納米探針的穩(wěn)定性及其在復雜生理環(huán)境下的各種物理化學性能也需要進行仔細的研究。2. 基于多元協(xié)同界面的電化學納米

26、生物傳感器研究電化學分析方法的測試信號來源于界面上的電子傳輸或界面電學特性的瞬變。靈敏度和響應速度取決于界面的傳質速率和電子交換速率，在特定的基體也就取決于修飾界面的特性；識別能力、選擇性則取決于電極的功能化程度和可控程度；傳感器的、穩(wěn)定性、測定范圍、檢測限以及其它宏觀響應的特性既與待測物質的物性有關，又取決于組裝與修飾界面物質的性質及其微結構。電化學生物傳感器將生物探針固定在電極上,并將界面發(fā)生的生物分子識別反應通過電信號導出，從而實現(xiàn)對生物分子的識別。通過構筑納米界面并結合納米信號探針的放大技術，能夠發(fā)展手持式的便攜、靈敏、廉價的電化學納米生物傳感裝臵，實現(xiàn)對PSA的快速靈敏檢測以滿足癌大

27、規(guī)模低成本篩查的要求。2.1設計電化學電極的多元協(xié)同傳感界面，PSA抗原響應性電極 采用絲網(wǎng)印刷技術表面均一的電極和電極陣列。通過對表面納米改性，在電化學輔助下形成一層納米金均勻修飾的生物相容性界面。通過巰基-金鍵作用，將生物捕獲探針（對PSA特異性識別的抗體或抗體片段）共價組裝在納米金相容性界面上，對PSA抗原有特異性響應的生物敏感膜修飾電極。通過納米金修飾可以有效提高表面積，以增加抗體的表面覆蓋度，并通過納米界面的形成提高擴散速度，增加PSA到表面的擴散能力，并提高抗原-抗體結合的能力。應用納米組裝技術構建納米生物信號放大探針。選擇生物識別探針分子（對PSA特異性識別的抗體或抗體片段，與捕

28、獲探針配對），通過巰基-金鍵或氨基-羧基的成肽反應等共價連接方式，利用其本身攜帶或衍生的基團實現(xiàn)其與納米粒子表面的偶聯(lián)；設計信號負載體（DNA寡核苷酸或酶聚合體）修飾方案，同樣，通過共價連接方式，使負載體與納米粒子表面實現(xiàn)偶聯(lián)。優(yōu)化反應物比例、溶劑、溫度、離子強度、值、時間、催化劑等各項偶聯(lián)條件，控制探針和信號載體的組裝數(shù)量及三維形態(tài)，使該納米復合結構中的生物分子保持后續(xù)生物反應活性（蛋白質探針的配體識別性能和信號放大性能）；同時減少兩種生物探針分子與納米粒子之間的非特異性結合，通過洗滌、更換溶劑、提高離子強度等方法，優(yōu)化該納米生物復合結構的后處理條件，提高其穩(wěn)定性和耐受性。2.2 研制基于電

29、化學傳感技術的PSA檢測將上述具有特異性的生物敏感膜修飾電極和納米信號放大探針通過區(qū)域模塊裝配的模式設計研制用于單樣品檢測的單通道探頭和多樣品并行檢測的多通道傳感探頭。在該探頭的前端設臵樣品前處理模塊（為濾膜或濾芯等），主要用于對復雜生物流體（或血漿）中的高豐度干擾物質（如血細胞和）進行過濾，排除其在生物捕獲敏感區(qū)域的非特異性吸附而造成的，并有利于提高捕獲探針和信號探針的結合能力，改善信噪比。探頭區(qū)域的流體動力控制通過微流控結構或微管路系統(tǒng)來實現(xiàn)與檢測銜接。 通過生物傳感探頭與電化學檢測及數(shù)據(jù)分析模塊的集成構建快速電化學生物檢測技術。調試傳感單元、控制單元、信號與放大單元、數(shù)據(jù)處理單元的穩(wěn)定性

30、和協(xié)同性。通過用戶友好型的界面使單/多通道便攜式電化學生物傳感器的功能得以呈現(xiàn)。2.3 電化學納米生物傳感器的綜合評價對于所制作的單/多通道便攜式電化學生物傳感器，應用多種實驗和儀器手段（包括電子學和化學分析儀器），進行其物化性能指標的綜合評價。優(yōu)化制作條件，使其綜合性能指標誤差控制在合理范圍以內。然后，將該傳感器初步應用于或血漿樣品PSA的檢測。分析靈敏度、特異性、準確度、精確度、相關性等生物檢測技術指標，評價所構建的多通道便攜式電化學生物傳感在復雜生物體系中的表現(xiàn)，驗證其在超微量生物傳感探測中的性能。3. 基于多元協(xié)同界面的癌標志物的納米生物檢測方法研究為了進一步提高癌早期的特異性，發(fā)展包

31、括多種靶標的聯(lián)合檢測方法是一個行之有效的途徑。為此，需要建立針對不同靶標的納米檢測方法。本課題擬基于時間分辨熒光和共軛高分子探針兩個發(fā)展PSA和其它新型蛋白靶標、水平的甲基化靶標、microRNA靶標和小分子代謝物靶標等多種指標的聯(lián)合檢測技術，為利用多指標聯(lián)合檢測來有效降低PSA篩查中的假陽性率提供技術。3.1建立基于時間分辨熒光檢測的蛋白質和小分子檢測系統(tǒng)時間分辨熒光具有靈敏度高，復雜組分辨識度好等優(yōu)點，作為一種常規(guī)的檢測在生物傳感方面發(fā)揮著其優(yōu)勢，是定量測定蛋白質和小分子的常用方法。而利用具有光物理和光譜特性的稀土材料標記靶標，可以使樣品不受自然熒光干擾，從而達到極高的信噪比。因此，通過納

32、米技術與以上兩方面技術的融合進一步提高檢測的靈敏度：1）將抗體或的抗體片斷捕獲探針固定在微孔板上，通過界面納米設計實現(xiàn)抗體探針的均一、定向組裝，以提高在界面的識別捕獲效率。2）利用課題一設計的稀土（Eu)納米粒子與二抗構建納米信號探針。每個探針中含有數(shù)千至數(shù)萬個Eu稀土原子，可以激發(fā)產生比常規(guī)稀土Eu標記高3-4個數(shù)量級的時間分辨熒光，易于信號的捕捉，從而顯著提高目標的檢測靈敏度。具體體現(xiàn)在：1）實驗驗證界面納米調控對于提高界面反應中的效率和降低背景信號等方面的作用；2）將基于稀土納米粒子的分析結果與同等情況下的基于Eu標記的結果進行比較，評價納米探針在靈敏度、特異性方面的優(yōu)勢；3）將同步分析

33、多種類和多濃度的蛋白和小分子靶標（PSA，fPSA，肌氨酸等），建立稀土納米粒子的信號與靶分子種類及濃度之間的對應關系圖譜，依此得出多元分析的靈敏度、信噪復性、穩(wěn)定性和信號均一性等性能指標；4）將含有多種類高豐度干擾蛋白的體液樣本進行基于上述的多批次分析，評價對生物樣本中低豐度蛋白進行分析的靈敏度和特異性狀況；5）檢驗其性能并驗證復合探針對提高低豐度蛋白分析的陽性率和抗雜蛋白干擾等方面的優(yōu)越性。3.2建立基于核酸擴增和水溶性共軛聚合物信號放大的核酸檢測系統(tǒng)共軛聚合物具有強的光捕獲能力，具有倍增光學響應性，可用來放大熒光傳感信號?；诠曹椌酆衔锏男滦蜕飩鞲衅髟卺t(yī)療、環(huán)境檢測以及國家安全防御等方

34、面具有廣泛的應用前景。在本研究中將利用水溶性共軛聚合物探針的高效熒光信號放大作用，通過將核酸擴增與熒光能量轉移（FRET）技術結合起來檢測癌相關的DNA甲基化和中microRNA靶標含量，優(yōu)化檢測條件，提高檢測的準確性和靈敏度。在檢測原理上這一部分擬分為兩種方法，一種為傳統(tǒng)的由共軛聚合物向有機的熒光能量轉移，通過測量放大后的穩(wěn)態(tài)熒光傳感信號進行生物分子的檢測。另法擬將共軛聚合物納米材料探針與稀土納米探針相結合，通過能量轉移放大稀土納米探針的瞬態(tài)時間分辨熒光信號進行生化檢測。這兩種方法中前者通過穩(wěn)態(tài)熒光的FRET檢測方法已經(jīng)成熟，可行性好，將直接用作項目中癌相關分子的檢測；而后者通過瞬態(tài)熒光的F

35、RET檢測技術有可能進一步提高現(xiàn)有檢測方法的靈敏度，將作為新的技術進行研發(fā)。利用共軛聚合物熒光探針通過FRET技術，結合單堿基延伸反應以及甲基化DNA特異性剪切酶，檢測DNA甲基化以及堿基突變。具體體現(xiàn)在：1）針對前列以及正常人群血漿、尿液樣本提取DNA，對相關的甲基化程度進行系統(tǒng)分析；2）研究癌P504 s、P63、CK34、El2等易感的突變，探索疾病與特定以及多個聯(lián)合的關聯(lián)性；3）通過對癌發(fā)生及早期發(fā)展過程中變化分析，研究多個與癌的累積疊加效應，發(fā)展具有高特異性、度的癌早期技術。 microRNA在血液中通常以極微量形式存在，因而需要擴增技術來提高其濃度。之前已發(fā)展了滾環(huán)擴增（RCA）的

36、技術，通過設計核酸納米結構作為引物，可以有效將極微量的microRNA靶標從樣品中擴增出來。之后通過共軛聚合物探針的高效熒光能量轉移效應，可以實現(xiàn)microRNA的熒光檢測。3.3新型癌納米檢測技術的性能評價 根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局體外試劑相關規(guī)定，對發(fā)展的癌生物標志納米檢測技術進行性能評估，主要包括：準確度、精密度、線性范圍、最低檢測限（分析靈敏度）、特異性、高濃度Hook效應及樣本稀釋、參考值（范圍）確定和試劑穩(wěn)定性研究等。癌納米檢測技術在篩查與驗證中的應用研究 整體技術思路如下4.圖所示：性或惡性疾病、外表正常、無任何可見疾病癥狀的人。各組病例至少300例，每一組受試者的最小入選人數(shù)

37、均滿足統(tǒng)計學分析的基本要求，所有入選病例均簽知情同意書，并具備完整臨床資料和隨訪情況。外周血樣本經(jīng)抗凝和離心處理分兩部分分裝，一部分為，另一部分為血細胞，分別置-20 度保存；液列腺，無菌試管內置-80 度保存；組織經(jīng)穿刺或手術切除后置無菌試管內，后置-80 度保存?zhèn)溆谩?.2電化學納米生物傳感器的臨床前研究在樣本庫中的相關的良惡性疾病組和正常對照人群組選取至少各300 例，使用發(fā)展的電化學納米生物傳感器對 PSA 進行檢測，測試其臨床靈敏度和特異性，并利用 ROC 曲線確定合適的參考值（范圍）。另外，至少對 100例特定的癌患者進行手術前后的隨訪監(jiān)測研究，以該納米生物傳感器列預后判斷、療效監(jiān)

38、測和復發(fā)等應用中的價值。對臨床試驗結果的統(tǒng)計選擇合適的統(tǒng)計方法，如相關分析、線性回歸、受試者工作特征（ROC）曲線分析、靈敏度、特異性、準確度、陰/陽性符合率、cut-off值等；對于對比實驗的等效性研究，主要是對考核試劑和參比試劑兩組檢測結果的相關及線性回歸分析，重點觀察相關系數(shù)（r值）或判定系數(shù)（R2）、回歸擬合方程（斜率和y軸截距）等指標。 同時對該電化學納米生物傳感器進行經(jīng)濟學評價，主要包括費用-最小化分析、費用-有效性分析、費用-有益性分析和費用-有用性分析。4.3 多指標聯(lián)用模型的構建及評估利用建立的癌生物樣本庫，使用基于多元協(xié)同界面的多種納米傳感方法對相關靶標分子進行檢測。將得到

39、的大量數(shù)據(jù)作為統(tǒng)計分析的X矩陣，應用遺傳算法、遞歸特征消除等算法從實驗得到的大量指標中選擇影響癌的主要特征，研究這些不同靶標分子對于判斷癌發(fā)生和發(fā)展的響應性以及多個靶標分子之間的相互關聯(lián)情況。結合支持向量機、隨機森林、網(wǎng)絡等機器學習算法以及和一致性模型相結合，建立多指標聯(lián)用的癌模型，根據(jù)建立的模型對癌進行以及對可能出現(xiàn)癌的幾率做出評估。此外，用多種模型驗證方法對模型的穩(wěn)定性、可靠性以及應用域等進行合理的評價。重點多指標聯(lián)用的癌模型的特異性指標，是否有效降低了假陽性。4.4分子靶標檢測與臨床特征的關系研究或體液（液）樣本的，蛋白和小分子代謝物靶標檢測具有取樣方便，檢測方法易定量，流程快速和便于質

40、量控制等優(yōu)點，而組織樣本的或蛋白檢測具有特異性強，敏感性高，定位準確，形態(tài)和功能相結合的優(yōu)點，比較分子靶標在兩類樣本中檢測效能，確定基于或體液分子靶標檢測的有效性；通過分析分子靶標與癌患者臨床特征（，瘤體大小，分期，分級，ER和PR表達，有無淋巴及遠處轉移，預后，生存期等）相關性，確定其臨床實用性，深度挖掘分子靶標列鑒別與分期，預后判斷，療效監(jiān)測和復發(fā)判斷中價值。3）創(chuàng)新點與特色：（1）在研究對象上，直面癌早期檢測這一具有很強針對性和現(xiàn)實性。癌是在我國隨著社會的到來正“爆發(fā)”，而多年來的臨床結果證明癌研究相對透徹，可干預性好，即在早期發(fā)現(xiàn)后的治療有效，率低。本項目特別針對我國的現(xiàn)實情況，基于電

41、化學檢測方法發(fā)展便攜式的快速、廉價的納米生物傳感器用于癌的早期普查，希望對的癌能實現(xiàn)有效的控制和降低致死率。本項目的另一個重要方面是希望通過多指標聯(lián)合檢測，顯著降低基于PSA篩查的假陽性率，減少患者需穿刺活檢的痛苦。（2）在研究思，以納米界面生物分子的作用機制為突破口。通過深入研究納米界面上的生物分子的物理化學過程，揭示其在擴散、對流和反應過程中的特殊納米效應。特別是通過向生物體學習，設計多元、協(xié)同的納米界面來同時解決生物檢測中靈敏度和選擇性問題；通過對生物分子在納米界面上的識別過程中的構象變化信息的理解來設計全新的生物傳感策略以增強特異性。在此系統(tǒng)研究基礎上，研制出具有通用的，可在不同種類的

42、擾背景下檢測出超低濃度的靶標分子的納米生物檢測方法。（3）在應用出口上，重點突出納米生物檢測新原理和新方法的器件化。通過本項目的開展研制出一套具有知識的電化學納米生物傳感器件，用于癌的早期篩查；以及一套多指標聯(lián)合檢測系統(tǒng)，用于癌的早期高特異性驗證。這兩套器件可以聯(lián)合配套使用，即用電化學納米生物傳感器件進行大規(guī)模篩查，發(fā)現(xiàn)的癌疑似病例再用多指標聯(lián)合檢測系統(tǒng)進行復查。復檢陽性結果的才需要進行進一步的穿刺活檢，從而大幅降低臨床穿刺的假陽性。這兩套器件的研發(fā)將有助于癌的防治工作，而且有可能成為一個通用型的檢測，應用于其它腫瘤或傳染性疾病的檢測。4) 課題設置課題1 ： 界面納米結構的構筑與生物分子作用

43、機制的基礎研究經(jīng)費比例： 21%承擔： 蘇州大學、中國高能物理課題：課題2 ： 基于多元、協(xié)同界面的電化學納米生物傳感器研究經(jīng)費比例： 21%承擔：大學、交通大學課題：課題3： 基于多元、協(xié)同界面的癌標志物的納米生物檢測方法研究經(jīng)費比例： 30%承擔： 中國應用物理、中國化學課題：課題4：癌納米檢測技術的臨床應用評價研究經(jīng)費比例：28%承擔：交通大學、大學課題：四、年度計劃研究內容預期目標第一年一系列高質量的功能納米材料，并實現(xiàn)其可控生長和粒徑可調；在金、碳或硅基底表面構筑精細納米結構，并建立一套簡便、重復性好的界面納米結構構筑的工藝流程；運用自組裝、原位沉積等傳感界面固定化方備對 PSA 抗

44、原有特異性響應的生物敏感膜修飾電極。通過多元協(xié)同納米界面的設計與優(yōu)化，在電極和電極陣列界面上構建納米結構，保持配體的穩(wěn)定性以及高效的識別能力；通過納米技術與時間分辨熒光檢測技術的融合進一步提高檢測的靈敏度，重點解決抗體在界面上的固定與納米探針的 問題；建立癌臨床病例選擇及生物樣本庫，對臨床試驗結果的統(tǒng)計選擇合適的統(tǒng)計方法同時對該電化學納米生物傳感器進行經(jīng)濟學評價。得到一系列高質量的功能納米材料并和各種精細納米結構界面；建立通用的 PSA 特異性傳感界面組裝方法；在納米界面上實現(xiàn)抗體探針的均一、定向組裝，提高在界面的識別捕獲效率；構建納米信號探針，每個探針中含有數(shù)千至數(shù)萬個 Eu 稀土原子，可以

45、激發(fā)產生比常規(guī)稀土 Eu 標記高 3-4 個數(shù)量級的時間分辨熒光；收集癌組和良性疾病組不少于 100 例，建立和完善前列生物樣本庫管理系統(tǒng)，建立前列生物樣本庫質量控制體系。在 此 過程 中研 究15-20 篇，申請專利 3-5 項。研究內容預期目標第二年對納米界面進行表面修飾與改性，實現(xiàn)生物識別分子在納米探針界面上的偶聯(lián) 可用于 癌腫瘤標志物檢測的納米生物探針；發(fā)展基于能量轉移的新原理和信號傳導與放大的新方法，實現(xiàn)生物識別信號的放大。設計與 各種類型的陣列式傳感基片，以及相配套的微流體通道及檢測裝置，提供集成式的陣列微流體傳感分析系統(tǒng)；將同步分析多種類和多濃度的蛋白和小分子靶標，建立稀土納米粒子的信號與靶分子種