細(xì)菌培養(yǎng)基制備滅菌以及接種培養(yǎng)技術(shù)

1、關(guān)于細(xì)菌培養(yǎng)基的制備滅菌及接種培養(yǎng)技術(shù)1第一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2第一部分細(xì)菌培養(yǎng)基的制備、滅菌目的要求實驗材料實驗程序第二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3目 的 要 求熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。第三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4實 驗 材 料藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水等。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱、細(xì)菌過濾器、酒精燈。其它：培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶、燒杯、玻璃珠等。第四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5實 驗 程 序玻璃器皿的洗滌和包裝培養(yǎng)基的制備無菌稀釋水的制

2、備培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌第五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月6實驗程序1 （玻璃器皿的洗滌和包裝）清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。棉塞的制作 包裝培養(yǎng)皿和移液管等。 第六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月7實 驗 程 序2 （培養(yǎng)基的種類）據(jù)組成成分可分為: 1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。 2.半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。 3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為 1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入1530g/L左右的瓊脂。 3.半

3、固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入35g/L左右的瓊脂。第七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月8實 驗 程 序2 （培養(yǎng)基的種類）常用凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。第八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月9實 驗 程 序2（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）1. 取一個300mL燒杯，裝150mL蒸餾水。2. 按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意： a. 前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分 b. 可加熱促進(jìn)各成分溶解 c. 加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補充因蒸發(fā)而損失的水量。培養(yǎng)基配方牛肉膏蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水pH數(shù)量0.75g1.5g0.75g3

4、g150mL7.6第九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月10實 驗 程 序2（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）3. 調(diào)pH值：用10 NaOH調(diào)pH至7.6，用精密pH試紙對照。4. 分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。注意不要污染棉塞和瓶口。5. 包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。6. 滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在37下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長，方可使用。第十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月11實 驗 程 序2 （培養(yǎng)基的分裝和斜面培養(yǎng)基的制作）每支試管裝的量為試管高度的1/41/3.斜面長度為試管長度的1/31/2.第十一張，PPT共

5、三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月12實驗程序2 （培養(yǎng)基的配制方法和步驟）第十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月13實驗程序3 （無菌稀釋水的制備）取一個250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶內(nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。另取5支18mm180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實驗中所需要的材料。第十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月14實驗程序4 （培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌）加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法 a. 將待滅菌

6、的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160并維持2h； b. 把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50左右，才能將物品取出。第十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月15實驗程序4 （培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌）濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下： 1. 滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。 2. 將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。 注意：器物不能裝得太滿。 3. 接通電源，進(jìn)行加熱。 4. 排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計指示溫度為100時關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時關(guān)閉排氣閥。第十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月16實驗程序4 （培養(yǎng)基和

7、玻璃器材等的滅菌） 5. 當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121)即開始滅菌，使其維持1530min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2) ，延長時間。 6. 滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。 7. 待培養(yǎng)基冷卻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆?。第十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月17第十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月18實驗程序4 （培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法）間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破

8、壞的培養(yǎng)基的滅菌。操作方法： a. 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100煮沸3060min，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。 b. 在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。 c. 第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。第十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月19實驗程序4（培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法）過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。第十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月2

9、0第二部分細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)目的要求實驗材料實驗程序第二十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月21目 的 要 求掌握從環(huán)境中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。掌握幾種接種技術(shù)。第二十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月22實 驗 材 料無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。第二十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月23實 驗 程 序細(xì)菌的純種分離細(xì)菌的接種方法第二十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年

10、6月24實驗程序1 （細(xì)菌的純種分離）稀釋平板法平板劃線法第二十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月25實驗程序1（細(xì)菌的純種分離稀釋平板法） 1. 取樣。 2. 將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號筆依次編上101、 102、103、104、105、106。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號為101無菌水(內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為101濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL 101濃度的菌液于編號為102無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為102濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到106

11、 。第二十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月26實驗程序1（細(xì)菌的純種分離稀釋平板法）稀釋液的制備第二十六張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月27實驗程序1（細(xì)菌的純種分離稀釋平板法） 3. 平板的制作 取10套無菌培養(yǎng)皿編號， 104、105、106各3個，另一個為空氣對照。 取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以106、105、104為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。第二十七張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月28實驗程序1（細(xì)菌的純種分離稀釋平板法） 3. 平板的制作 加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45左右

12、時，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。第二十八張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月29實驗程序1（細(xì)菌的純種分離稀釋平板法） 3. 平板的制作 取對照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。第二十九張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月30實驗程序1（細(xì)菌的純種分離平板劃線法）1. 平板制作：將融化并冷至約50的肉

13、膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。2. 劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30培養(yǎng)2448h后觀察結(jié)果。第三十張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月31實驗程序1（細(xì)菌的純種分離平板劃線法）第三十一張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月32實驗程序2（細(xì)菌的接種技術(shù)）接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、

14、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。圖6第三十二張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月33實驗程序2（細(xì)菌的接種技術(shù)斜面接種法） 左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時向上) 。右手將棉塞旋松，以便在接種時容易拔出。 右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。 將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。123第三十三張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月34實驗程序2（細(xì)菌的接種技術(shù)斜面接種法） 將已灼燒過的

15、接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。45678第三十四張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月35實驗程序2（細(xì)菌的接種技術(shù)液體接種和穿刺接種）液體接種法(從斜面菌種接入培養(yǎng)液)：用接種環(huán)挑取斜面菌種送入培養(yǎng)液中，使環(huán)在液體表面與管壁接觸輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入培養(yǎng)液中，取出接種環(huán)塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在培養(yǎng)液中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅滅菌。穿刺接種法(從斜面菌種接入(半)固體培養(yǎng)基)：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，挑取少量菌種，垂直地穿入試管固體培養(yǎng)基中心至底部，然后穿刺線緩慢將針抽出，塞上棉塞。燒紅接種針滅菌，則接種完畢。第三十五張，PPT共三十八頁，創(chuàng)作于2022年6月36實驗程序2（細(xì)菌的接種技術(shù)稀釋平板涂布法）稀釋樣品：方法同稀釋平板分離法倒平板：將融化并冷至50左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)志樣品液于平板上，換上無菌玻璃刮刀在平板上旋