酶工程第十節(jié)酶和現(xiàn)代生命科學

1、關于酶工程第十節(jié)酶與現(xiàn)代生命科學第一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、酶是分子生物學研究的重要工具 酶是分子生物學研究的重要工具。特別是限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)提供了特異剪切DNA的工具,促進了DNA重組技術誕生,推動了基因工程發(fā)展,成為分子生物學研究的不可缺少的工具. Hind 的識別序列和切割位點 5 - GTPy PU AC - 3 3 - CAPU Py TG - 5 第二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應用 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是根據(jù)人們預先設想，采用酶學的

2、方法，將目的基因（所需要的基因）重組到一個適宜的載體上組成重組子，再將重組子轉化到適當受體細胞中進行擴增表達，以達到改造生物細胞的目的的技術。 基因工程的整個過程由工程菌（細胞）的設計構建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成。前者主要在實驗室里進行，其單元操作過程如下：第三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因工程的單元操作過程如下：（1）從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開。 （2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到 載體分子上，形成DNA重組分子。（3）借助于細胞

3、轉化手段將DNA重組分子導入受 體細胞中。（4）短時間培養(yǎng)轉化細胞，以擴增DNA重組分子 或使其整含到受體細胞的基因組中。（5）篩選和鑒定轉化細胞，獲得使外源基因高 效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞。 第五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 關于限制性內(nèi)切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸內(nèi)切酶簡稱限制性內(nèi)切酶，是一類能識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點的脫氧核糖核酸水解酶。 主要存在于細菌、霉菌中，至今已分離到1000種以上，搞清識別序列的有300種以上。第六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有關限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)的幾個重要實驗 50

4、年代初，Luria和Human在研究T4噬菌體感染作用、Bertani和Weigle在研究和P2噬菌體與宿主細胞關系時，發(fā)現(xiàn)了細菌內(nèi)限制與修飾現(xiàn)象。 發(fā)現(xiàn)了細菌內(nèi)存在限制修飾系統(tǒng)，在這兩個系統(tǒng)中包括限制酶和修飾酶。限制酶能識別并降解與自身無關的外源DNA，而修飾酶則可通過甲基化修飾自身DNA，免被限制酶降解。 第七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Bertani和Weigle大腸桿菌噬菌體感染實驗Bertani和Weigle在探索和P2噬菌體與宿主細胞關系時，均提出了噬菌體感染大腸桿菌后，宿主細胞對入侵的噬菌體DNA表現(xiàn)有特異的限制作用。 CEcoli.CEcoli.CEcoli.K1

5、2大量繁殖受到抑制第八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Meselson和Yuan實驗噬菌體 K12和 C的DNA分別與由K12菌體制備的細胞抽提物保溫，并藉蔗糖密度梯度離心觀察兩種DNA沉降速度的變化。 K12 DNA C DNA加入K12菌體制備的細胞抽提物蔗糖密度梯度離心第九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 實驗表明，這種限制的本質(zhì)是宿主細胞K12中存在有能使外來DNA( CDNA)有限降解的核酸水解酶。 此后，又進一步證實了大腸桿菌K12中的修飾體系即為甲基化酶，該酶修飾了 K12 DNA上的特異部位，使其不被限制體系的酶切割。結論表明：第十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作

6、于2022年6月1965年阿爾伯首次從理論上提出了生物體內(nèi)存在著一種具有切割基因功能的限制性內(nèi)切酶。并于1968年成功分 離出I型限制性內(nèi)切酶與修飾酶。證實在細菌內(nèi)存在兩種不同功能但又相關的酶。1970年史密斯從流感噬血桿菌d株中分離出了II型限制性內(nèi)切酶；同年內(nèi)森斯使用該酶降解獼猴腫瘤病毒SV40的DNA，首次完 成了對基因的切割，排列了酶切圖譜。從此成為分子克隆技術中不可缺少的工具酶，推動了基因工程的發(fā)展。1978年，上述三人因?qū)ο拗菩詢?nèi)切酶的貢獻獲得諾貝爾獎。第十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月阿爾伯(1929) 瑞士微生物遺傳學家 H.O.史密斯(1931) 美國分子生物學

7、家、遺傳學家 內(nèi)森斯(1928) 美國微生物遺傳學家 第十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶命名規(guī)則 限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個字母(大寫)與種名的第一、二兩個字母(小寫)組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌有株系之分，則有4個或4個以上拉丁字母組成，其第四個字母之后表示株系。 如 EcoRI來源于Echerichia.coli RY13 BamHI來源于B.amyloliquefaciens第十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月H in d IIHaemophilus(屬名)Influenzae(種名)d(株系)羅馬數(shù)字限制性內(nèi)切

8、酶命名舉例第十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制性內(nèi)切酶分類 已發(fā)現(xiàn)的限制酶可以分為三類或稱作三型：I、II、III型。他們在酶反應中所需要的輔因子和切割DNA的位點都不相同，而且酶蛋白分子的大小和組成上也有差別。第十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 類別反應必須因子專一性 活性 I型S-腺苷基蛋氨酸，ATP，Mg2+識別部位和切點不同，無特定切割位點內(nèi)切甲基化 II型Mg2+切斷識別部位或其附近的特定部位只有限制酶活性 III型ATP，Mg2+識別部位和切點不同，但切斷特定部位內(nèi)切甲基化限制性內(nèi)切酶分類第十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PP

9、T共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、 II 型限制性內(nèi)切酶的特性 II型限制酶的識別特異性 回文識別序列 II型限制酶的識別序列大多是具有 雙重對稱結構性結構,或稱回文序列 (Palindromic Sequence)第十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 非典型回文識別序列 回文識別序列被一至幾個其他核苷酸（N）所間隔，得到的是非典型的雙軸對稱性序列。 Bgl I GCCNNNNNGGCMst II CCTNAGG第十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 非回文識別序列 也有些限制酶識別序列非回文結構，切割位點在距識別序列5至13個bp處。5 GACGCNNNNN 33

10、 CTGCGNNNNNNNNNN 5例：Hgn I GACGC第二十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有些限制酶可識別多重序列。如：Hind II，識別序列為GTPyPuAC，可識別三種序列。GTPyPuACGTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC嘌呤（Purine）嘧啶（Pyrimidine）類似的內(nèi)切酶還有 Acc I 、Ava I 、Ban I 、Hae I 等，它們的特異性低于單一識別序列的酶。第二十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 識別序列的長度與剪切頻率 大部分II型限制性內(nèi)切酶的識別序列長度為4-8個核苷酸。識別長度決定了剪切DNA的頻率（1/4n，

11、n為識別的長度）。識別長度愈長，則切點少、產(chǎn)生片段少而長度長，酶特異性高。第二十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制酶的切割特異性和酶切片段的末端結構 切割位點專一 作為工具酶的限制性內(nèi)切酶有固定的切割位點； 產(chǎn)物具有特定的末端結構 當一個DNA分子被限制酶切開后形成兩個末端，全部產(chǎn)物具有相同的末端結構。即一種限制性內(nèi)切酶切割任何DNA只產(chǎn)生一種固定形式的末端結構，在DNA連接酶的作用下，磷酸二酯鍵可以修復而成為一個重組的DNA分子；而不同限制酶則形成不同末端結構。5 - G3 - CTTAA +AATTC - 3 G - 55 - GAATTC - 33 - CTTAAG -

12、5 DNA連接酶5 - GAATTC - 33 - CTTAAG - 5第二十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 任何一種限制酶切割DNA鏈時，總是水解核苷酸 3、5-磷酸雙酯鍵的3位磷酸酯鍵，使產(chǎn)物的5端帶磷 酸單酯基團，而3為游離羥基。 由于切割位點不同，所有的限制酶可產(chǎn)生兩類末端結構 平末端（Blunt End）指酶切片段為齊頭末端結構 。 粘性末端（Cohesive End）酶切后DNA片段末端帶有 1-4個核苷酸殘基長度的單鏈結構 ，而片段 兩端突出的單鏈具有互補的序列。 粘性末端又可分為 5-粘性末端與 3-粘性末端。 5 NOH 3 5PO4N 3第二十四張，PPT共五

13、十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月粘性末端3-粘性末端5-粘性末端平末端 5 - GAATTC - 3 3 - CTTAAG - 5 EcoR I 5 -G AATTC - 33 -CTTAA G - 5 5 - CTGCAG - 3 3 - GACGTC - 5 Pst I5 - CTGCA G - 33 - G ACGTC - 5 5 - CCCGGG - 3 3 - GGGCCC - 5 Sma I5 - CCC GGG - 33 - GGG CCC - 5第二十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 有沒有例外？ （1）相同的限制性內(nèi)切

14、酶不總是產(chǎn)生匹配的片段A） 含多重識別序列的限制酶 如 Hind II 在順序GTPyPuAC 剪切，可產(chǎn)生3種不同 類型片段，互相連接的可能性為 1/3。B） 含非典型識別序列的限制酶 如 EcoN I 在順序CCTNNNNNAGC 剪切，N可以是任何核 苷酸，由于N的隨意性，往往會產(chǎn)生不廣泛匹配的片段。C） 在次理想條件下，限制酶表現(xiàn)出星狀活性，影響正常匹配。第二十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）不同的限制性內(nèi)切酶有時可以產(chǎn)生匹配的片段 例： BamH I GGATCCBcl I TGATCABgl II AGATCT 這類能產(chǎn)生相同粘性末端而識別特異性不同的限制酶稱作

15、同尾限制酶（Isocaudarner）。同尾限制酶產(chǎn)生的DNA片段可借DNA連接酶互相重組，但新產(chǎn)生的雜合序列將不再被原有的限制酶所識別。 5 - G GATCT - 3 DNA 5 - GGATCT - 3 3 - CCTAG A - 5 連接酶 3 - CCTAGA - 5 (BamH I 片段) (Bgl II 片段) (產(chǎn)生雜合識別序列) 第二十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶反應條件 按手冊或商品說明書 反應緩沖液：根據(jù)不同酶使用高、中或低鹽緩沖液。 常用的緩沖液選擇 Tris-Hcl 。同時還 要加入 Mgcl2 和 2-巰基乙醇。 反應溫度： 一般限制性內(nèi)切酶的反

16、應溫度是 37c。 酶活性單位： 1個酶活性單位是指一種酶在其最適宜的 反應條件下，1小時使 1g 噬菌體DNA 底物完全水解的酶量。但由于許多因素可 影響內(nèi)切酶的水解反應和用量，實際用量 需比所需用量多加一倍左右。第二十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 第二活性 在次理想條件下,一些限制性內(nèi)切酶的特異型會被降低,只有部分正常識別位置被識別,此稱為第二活性（Secondary Activity），也稱星號活性（Star Activity），加以“ *”表示，如 EcoR I*。酶的第二活性將引起底物DNA鏈上切口增多，酶解片斷變小，造成特異性降低。例：理想條件下 （PH=7.5）

17、EcoR I GAATTC 次理想條件下 （PH=8.5） EcoR I * AATT次理想條件：通常包括不適合的離子強度、過高的PH、 二價金屬離子的替換、較高的甘油濃度等。第三十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 限制酶的保質(zhì)期 一般是在檢定日以后的一年內(nèi)，但幾乎所有的限制酶在超過保質(zhì)期后都不會急劇失活, 因此購入后即使是經(jīng)過長時間保存的酶, 也完全可以使用，但這些酶在使用前最好再測一次活性。另外，保存酶時即便讓其凍結，大部分酶也不會急劇失活。 第三十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月EcoRI第三十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月PstI第三十三張，PPT共

18、五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月SmaI return第三十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 研究酶的理化性質(zhì)及其作用原理，對于闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律具有十分重要的意義（包括酶的結構功能、酶與代謝調(diào)節(jié)、酶與生物的生長、發(fā)育、進化、疾病等） 。 從酶分子水平去探討酶與生命活動、與代謝調(diào)節(jié)、與疾病、生長發(fā)育等等的關系，對闡明某些生命活動的本質(zhì)和規(guī)律，無疑也具有十分重要的意義。 二、酶是生命科學研究的重要對象第三十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶同工酶(isoenzyme)是指催化的化學反應相同，而酶蛋白的分子結構、理化性質(zhì)乃至免疫學性質(zhì)不同的一組酶,存在于生物的同一

19、種屬或同一個體的不同組織、甚至同一組織或細胞中。目前已發(fā)現(xiàn)有150多種酶具有同工酶，如6-磷酸葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、酸性和堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、過氧化酶和膽堿酯酶等。其中，發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶.第三十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月例：LDH同工酶的兩種亞基以不同比例組成五種四聚體：LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2)、LDH4(HM3)和LDH5(M4)。 Dogfish LDH M4結構圖 第三十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶與物種進化 同工酶是生物進化過程中為適

20、應愈趨復雜的代謝而引起的一種分子進化，以適應不同組織或不同細胞器在代謝上的不同需要. 同功酶在各器官和組織中的分布不同。這樣就可以根據(jù)同工酶酶譜差異并配合其它方法從分子水平探討物種進化、遺傳變異等一些生命現(xiàn)象。第三十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 在正常情況下血清中同功酶譜是相對穩(wěn)定的。當某一組織或器官發(fā)生病變時，就有某種特殊的同工酶釋放出來，引起血清中同功酶活性的改變。對病人及正常人同工酶電泳圖譜進行比較，有助于上述器官疾病的診斷。 在臨床上已應用同工酶做診斷指標,例如: 冠心病及冠狀動脈血栓引起的心肌受損者血清中LDH(H4)及LDH2(MH3)含量增高; 而肝細胞受損患者血

21、清中LDH5(M4)增高。第三十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 同功酶與其它 同工酶的研究不僅在臨床血液病、腫瘤及其它疾病的診斷方面占有重要地位，而且在分子遺傳學、物種鑒定、法庭取證、親子鑒定、優(yōu)生優(yōu)育等領域中也具有廣闊的應用前景。 第四十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 腫瘤的酶異常 腫瘤酶異常原因：1、腫瘤過多或過少產(chǎn)生酶2、腫瘤阻塞了酶通過的導管系統(tǒng)3、腫瘤誘導酶產(chǎn)生4、細胞通透性改變使可溶性酶進入血液循環(huán) 第四十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 臨床診斷還沒有單一指標可確診癌， 所以酶測定可作為一種輔助手段，如：測定血清淀粉酶胰腺癌酸性磷酸酶前列腺癌

22、亮氨酸氨肽酶、硫酸酯酶、乳酸脫氫酶等同工酶譜變化肝癌、結腸癌、直腸癌。第四十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒酶 端粒、端粒酶與腫瘤發(fā)生的關系是近年來腫瘤研究領域的熱點之一。有研究表明,端粒酶在85%95%的惡性腫瘤組織中有陽性表達,而在正常體細胞則一般為陰性。因此端粒酶抑制劑的研究為惡性腫瘤的早期診斷、預后估計及基因治療開辟了一個新的途徑。第四十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 端粒(telomere) 真核細胞染色體末端以 TTAGGG 6個堿基序列重復組成的DNA結構人體細胞染色體端粒長度約為515Kb,其功能在于保護染色體免受核酶降解,防止斷端融合重排或降解。

23、如果端粒長度縮短到極限如4Kb以下時,細胞則會喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡,該過程稱為監(jiān)控點激活(checkpoint activation)。端粒縮短被認為是正常細胞分裂與老化的分子信號,端粒被稱為細胞壽命的“分裂鐘”。第四十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒的保護機制 在真核細胞,端粒DNA的富G鏈較富C鏈超出約1216bp,形成3端的突出單鏈結構,而端粒蛋白質(zhì)能夠特異地識別這一突出區(qū)域并與之結合,再通過進一步的折疊、盤曲,從而形成染色體末端具有保護功能的“帽子”,在防止染色體互相融合、重組等方面都發(fā)揮著十分重要的作用 第四十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月端粒酶(telomerase) 依賴RNA的DNA聚合酶,其實質(zhì)是一種核