逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)中細(xì)節(jié)問(wèn)題

1、關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)中的細(xì)節(jié)問(wèn)題第一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RT-PCR原理第二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)器具與材料試劑 標(biāo)本收集與保存 RNA抽提逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)介紹內(nèi)容第三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、實(shí)驗(yàn)器具、材料1、移液槍：1ml、200l、20l2、吸頭及吸頭盒：1ml、200l、20l （無(wú)菌無(wú)酶，可直接購(gòu)買）3、EP管：1.5ml （無(wú)菌無(wú)酶，可直接購(gòu)買）4、PCR薄壁管 0.2ml 5、普通EP管：1.5ml、O.5ml（高壓滅菌） 6、大瓷缸：2個(gè) （180的高溫干烤6h，滅活RNA酶，存放無(wú)酶E

2、P管和PCR管） 7、組織搗碎棒（可直接購(gòu)買）第四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、DEPC水 500ml。 2、75%乙醇：用無(wú)水乙醇 DEPC水配，然后放4保存3、異丙醇4、氯仿5、電泳緩沖液(TAE/TBE)7、瓊脂糖8、Taq酶（含MgCl2 Buffer）,-20 9、dNTP ,-20 10、隨機(jī)引物,-20 11、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Buffer) ,-20 12、RNasin ,-20 13、Trizol 100ml/1瓶 ,-4 14、Marker, -20 15、引物,-20 二、試劑第五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、標(biāo)本收集與保存 1、細(xì)胞：

3、 懸浮細(xì)胞：1500rpm,5min離心，取沉淀-80 凍存，或直接抽RNA; 貼壁細(xì)胞：倒掉培養(yǎng)液，加Trizol 1ml,溶解細(xì)胞，直接抽RNA或凍存（如沒(méi)有Trizol，可用胰酶消化后，同懸浮細(xì)胞處理）2、組織： 液氮取材（越快越好），-80 凍存：即可用于抽RNA,也可用于抽蛋白； RNA保護(hù)劑取材:用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白； Trizol取材：同上； -80 冰袋取材：沒(méi)辦法的辦法。 目的：防止RNA被RNA酶降解措施：低溫、RNA酶抑制劑、盡快取材防止細(xì)胞裂解第六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、RNA抽提 目的：防止RNA被RNA酶降解，獲得高質(zhì)量的RNA措施

4、：1.了解RNA酶的來(lái)源及應(yīng)對(duì)方法：（1）內(nèi)源性：組織細(xì)胞裂解釋放（低溫、RNA酶抑制劑）（2）外源性：實(shí)驗(yàn)者的皮膚分泌物、呼吸氣體、唾液等（帶手套、口罩）；（3）實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的灰塵、微生物等（環(huán)境清潔、消毒、在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行）；（4）實(shí)驗(yàn)器械（進(jìn)行無(wú)酶處理）：180的高溫下干烤6h；0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具不能使用）；用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制溶液。 第七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、了解RNA抽提的步驟原理，知道哪些是需要注意RNA酶污染的關(guān)鍵步驟，做到膽大心細(xì)。舉例如下：TRI REAGENT 分離RNA PROTOCOL1）510106

5、細(xì)胞沉淀，加TRI Reagent 1ml,反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞溶解。 50 - 100 mg 組織加 1 ml TRI Reagent于勻漿器中勻漿 （注意：標(biāo)本體積不得超過(guò)TRI Reagent 體積的10% ）2）將勻漿于室溫靜置 5 分鐘（此步后將樣本置-80 至少可保存一個(gè)月）3）然后向勻漿中加 入0.2 ml氯仿, 蓋緊樣本劇烈振搖15秒4）將混合物室溫靜置 2-15 min，12,000 g ，4離心 15 min （低溫離心很重要，否則，水相中會(huì)混入少量的DNA）(離心后原混合物分為底層紅色的 酚氯仿相, 中間相和上層無(wú)色的水相。 RNA 存在于水相，而DNA 和蛋白質(zhì)分別存在于中間

6、相和有機(jī)相。水相的體積大概占用于勻漿的TRI Reagent總體積的 60%。)5)轉(zhuǎn)移上層無(wú)色的水相至新的管子中,加 0.5 ml異丙醇（從水相中沉淀RNA），室溫靜置 5-10 分鐘6) 12,000 g，4 離心 8 min. 此時(shí)可見(jiàn)RNA 沉淀(離心前通常看不見(jiàn)) 于管底或側(cè)壁形成膠凍狀或白色沉淀。第八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7)移去上清，加至少1 ml 的 75% 乙醇洗滌RNA 沉淀 ( 用 渦旋)，（此時(shí)RNA可至于75% 乙醇中存于 4 至少一周或存于-20 至少一年）8)然后于 7,500 g ， 4 離心 5 min（如 RNA沉淀積于管壁一側(cè)和傾向于漂

7、浮，于12,000 g沉淀）9)移去上層的乙醇洗液，將RNA沉淀置空氣中短時(shí)干燥.（ 注意不要讓RNA沉淀完全干燥，因?yàn)檫@樣將極大的降低其可溶性。但對(duì)于用于RT-PCR的樣本而言，應(yīng)盡量讓RNA樣本中的乙醇揮發(fā)，這對(duì)5-20微升的小體積樣本尤其重要） 10)用30-50mlRNase-free的水溶解RNA幾分鐘，可用吸頭吹幾下（如還不溶于55-60 孵育 10-15 分鐘） 11)濃度質(zhì)量檢測(cè)所需試劑：TRI Reagent （Molecular Research Center,INC.，Cat. No. TR 118）RNase-free的水（上海生工 Cat. No：D1005100ml

8、）氯仿、異丙醇、乙醇所需器材：組織搗碎棒（RNase-free，上海華舜 Cat. No：W1220）RNase-free，1.5ml離心管1ml，200微升、20微升 tip （RNase-free，已消毒盒裝)第九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、RNA質(zhì)量檢測(cè)1）檢測(cè)RNA溶液的吸光度 OD260/OD280 = 1.82.0表示優(yōu)質(zhì)（ 280、260nm下的吸光度分別代表了核酸、和蛋白值），并可以檢測(cè)濃度;2）RNA的電泳圖譜：檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，RNA的質(zhì)量是好的;3

9、）保溫試驗(yàn)（檢測(cè)有無(wú)微量RNA酶殘留）4)直接逆轉(zhuǎn)為cDNA，進(jìn)行管家基因（如b-actin）PCR，瓊脂糖電泳后，如有相應(yīng)的產(chǎn)物條帶，則說(shuō)明RNA可以使用5、RNA保存：-80 凍存；或逆轉(zhuǎn)為cDNA保存（更安全）4、DNA污染的檢測(cè)與處理1）檢測(cè)方法： a:用沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR，有產(chǎn)物生成，提示污染 b:設(shè)計(jì)上下游引物，使其與DNA互補(bǔ)位點(diǎn)之間包含內(nèi)含子，來(lái)源于cDNA的PCR產(chǎn)物會(huì)比來(lái)源于沾染的基因組DNA的產(chǎn)物短 2）處理：在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級(jí)的DNase對(duì)RNA進(jìn)行處理 第十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 目的：以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cD

10、NA措施：1.獲取優(yōu)質(zhì)的RNA;2.采用優(yōu)質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)：逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶H活性。最適42。 MMLV(Moloney 鼠白血病病毒)：逆轉(zhuǎn)錄酶活性強(qiáng)，RNA酶H活性較弱。最適37或42。 3.引物選擇:隨機(jī)引物:適用于長(zhǎng)的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA,特異性最低;。 Oligo(dT)：適用于具有PolyA尾巴的RNA 特異性引物：與目的序列互補(bǔ)，是反義寡核苷酸，適用于目的序列已知的情況 4、質(zhì)量檢測(cè)：進(jìn)行管家基因（如b-actin）PCR5、產(chǎn)物保存：-20 第十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月First-Strand Synthesis of cDNA舉

11、例1.試劑(1) M-MLV Reverse Transcriptase (200u/ul) （promega，Catalog#M1701)(2) M-MLV 5Reaction Buffer(3) rRNasin (40u/ul) （promega）(4) dNTP(10mM each) （生工）(5) Random Primers （生工）(6) Nuclease-Free Water2.操作步驟（1)Total RNA2 ugPrimer (0.5ug/ul)2 ul Note: 0.5ug/ug mRNANuclease-Free Water11 ulAdd to 15 ul70 ，5

12、分鐘以溶解模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，取出立即置冰上冷卻（防止二級(jí)結(jié)構(gòu)重新形成），簡(jiǎn)單離心。第十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月M-MLV 5Reaction Buffer5 uldNTP(10mM each)1.25 ulrRNasin (40u/ul)0.6 ul=25 uM-MLV Reverse Transcriptase (200u/ul)1 ulNuclease-Free Water2.15 ulTotal Volume 25 ul輕彈PCR管，使其混勻，簡(jiǎn)單離心。（3）在PCR儀上執(zhí)行37 60min（Random Primers，其它引物如 Oligo(dT)用42 ）。（4）

13、70 10分鐘后進(jìn)行PCR或20 保存?zhèn)溆?。?）在冰上依次加入下列試劑：第十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月六、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 目的：以cDNA為模板大量擴(kuò)增目的基因片段措施：1.合適的PCR引物;2.合適的Taq酶；3.PCR條件的優(yōu)化第十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR引物設(shè)計(jì)原理第十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR引物選擇與設(shè)計(jì)引物選擇與設(shè)計(jì)1.引用文獻(xiàn)（影響因子較高的雜志或使用頻率較高）;2.找引物合成公司設(shè)計(jì)；3.自己設(shè)計(jì):目的不同引物要求也不同：1.用于分子克隆的引物：應(yīng)涵蓋目的基因全長(zhǎng)，引入酶切位點(diǎn)；2.用于定性或半定量的

14、PCR引物：涵蓋部分目的基因即可（ 200bp)；3.用于real-time PCR的引物：涵蓋的目的基因不宜太長(zhǎng)（150-250bp)第十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)舉例 以大鼠olig2的引物設(shè)計(jì)為例1、查找大鼠olig1 mRNA堿基序列第十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)第十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于202

15、2年6月第二十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四種重要指標(biāo)：發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)、二聚體(Dimer)、錯(cuò)誤引發(fā)情況(False Priming) 、上下游引物之間二聚體形成情況(Cross Dimer) 第二十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Sense:5 ACCTCCGACGCCAAGTGA 3Anti-sense

16、:5 CGGTTCCCAAATAATACGC 34、引物同源性分析（用Blast進(jìn)行同源性比較） 檢查引物的特異性3、Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)的大鼠olig2引物第二十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十二張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十三張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十四張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十五張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、Blast進(jìn)行同源性比較，確認(rèn)引物的特異性后，聯(lián)系公司，合成引物6、引

17、物的溶解和稀釋上下游引物干粉各加適量消毒雙蒸水(滅菌注射用水)稀釋至20M, -20保存.第三十六張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR舉例第三十七張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意：此PCR反應(yīng)條件中缺預(yù)變性（94，5min)和最后的產(chǎn)物延伸（72 ，10min)第三十八張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA瓊脂糖凝膠電泳 準(zhǔn)備試劑：1電泳緩沖液：(TBE或TAE均可）(1)5TBE:Tris 54 g Boric Acid 27.5 g0.5molL EDTA 200 mL pH=8.0定容至1000 ml。

18、 (2)50 xTAETris 242 g冰醋酸 57 mL0.5molL EDTA 200 mLpH 8.0 定容至1000 ml。 2凝膠加樣緩沖液(6)3瓊脂糖 4溴化乙錠溶液(EB) 10mgmL 5DNA 分子量Marker第四十張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)步驟 配膠（1瓊脂糖凝膠）0.3 g 瓊脂糖加入30 ml 0.5TBE中，搖勻；在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解；冷卻到60，加入3l的EB，并搖勻. 制膠：把梳子插入制膠槽相應(yīng)位置，將融解的瓊脂糖倒入，室溫冷卻凝固，垂直向上拔出梳子，將凝膠連同膠槽置入電泳槽中，加0.5TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。

19、(3) 點(diǎn)樣：用移液搶吸取PCR產(chǎn)物5l于塑料紙上，再加入1l 的6加樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。 (4) 電泳：（由負(fù)極向正極電泳）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)至合適電壓(一般電場(chǎng)強(qiáng)度不要超過(guò)5Vcm )；可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約15min-30min。(5)觀察：關(guān)掉電源，將凝膠小心的從電泳槽中取出，置于紫外透射檢測(cè)儀上觀察，拍照，并分析。第四十一張，PPT共四十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化（一）PCR反應(yīng)的緩沖溶液提供合適的酸堿度和某些離子1050mmol/L Tris-HCl緩沖液50mmol/L KClBSA或明膠（二）鎂離子濃度Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+濃度過(guò)高導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。一般常用1.5mmol/L三）底物濃度dN