實驗一 質粒DNA的提取和鑒定

1、質粒DNA的提取和純化 生化與分子生物學系1分子生物學從分子水平上研究生命現(xiàn)象物質基礎的學科。研究細胞成分的物理、化學的性質和變化以及這些性質和變化與生命現(xiàn)象的關系，如遺傳信息的傳遞，基因的結構、復制、轉錄、翻譯、表達調控和表達產(chǎn)物的生理功能，以及細胞信號的轉導等。 2基因工程3移液器和EP管4質 粒質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，獨立于染色體之外的、能自主復制的雙鏈環(huán)狀脫氧核糖核酸物質。質粒的存在使宿主具有一些額外的特性，如對抗生素的抗性等。F質粒(又稱F因子或性質粒)、R質粒(抗藥性因子)和Col質粒(產(chǎn)大腸桿菌素因子)等都是常見的天然質粒。 能穩(wěn)定地獨立存在于染色體外，并傳遞到子

2、代，一般不整合到宿主染色體上?，F(xiàn)在常用的質粒大多數(shù)是經(jīng)過改造或人工構建的，常含抗生素抗性基因，是重組DNA技術中重要的工具。 5分類：單拷貝質粒；多拷貝質粒；緊密控制型；松弛控制型；67質粒DNA的提取方法堿裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法； 概括起來主要是用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理。8基本思路培養(yǎng)細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分離質粒DNA(有時還要求純化質粒DNA，根據(jù)實驗所需)電泳檢測；9堿裂解法的基本原理十二烷基磺酸鈉(SDS) 可使細胞膜裂解。經(jīng)SDS處理后，細菌染色體DNA會纏繞附著在細胞碎片上，同時由于細菌染色體DNA比質粒大得多，易受機械力和核

3、酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性片段。當用強熱或酸、堿處理時，細菌的線性染色體DNA變性，而共價閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circularDNA，簡稱cccDNA)的兩條鏈不會相互分開。當外界條件恢復正常時，線狀染色體DNA片段難以復性，而是與變性的蛋白質和細胞碎片纏繞在一起，而質粒DNA雙鏈又恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解狀態(tài)存在于液相中。10實驗步驟1、將含有質粒DNA的細菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。取1.5ml LB培養(yǎng)液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g離心30秒。 2、棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上數(shù)分鐘，使液體流盡。 3、菌

4、體沉淀重懸浮于100l溶液中（需劇烈振蕩）。 4、加入新配制的溶液200l，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數(shù)次，以混勻內容物（千萬不要振蕩），冰浴2分鐘。 5、加入150l預冷的溶液，蓋緊管口，顛倒混勻，冰浴中5分鐘，4下12000g離心10分鐘。6、上清液（450uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積的飽和酚（1:1），充分顛倒混勻，4下12000g離心10分鐘。 117、將水相（400uL）移入干凈eppendorf管中，加入等體積酚/氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心10min。8、將水相（350uL）移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混

5、勻后置于-20冰箱中20分鐘，然后4下12000g離心10分鐘。 9、棄上清，將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次，4下12000g離心5-10分鐘。 10、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，真空干燥10分鐘或室溫干燥。 11、將沉淀溶于10l TE緩沖液（pH8.0，含20g/ml RNaseA）中，儲于-20冰箱中。12LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani）稱取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣

6、滅菌20分鐘。13溶液I50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲存于4冰箱溶液I：重懸細菌；葡萄糖：比重大，使細菌不易沉淀；TrisHCl：緩沖體系；EDTA：螯合金屬離子；14溶液0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1SDS溶液II破膜，變性基因組DNA和蛋白質；SDS破膜作用，變性蛋白質；NaOH破膜，變性基因組DNA；15溶液5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高壓滅菌。

7、溶液終濃度為：K+3mol/L，Ac5mol/L。溶液III中和溶液，復性質粒DNA；16酚/氯仿（1:1）酚變性蛋白質；氯仿萃取溶液中的酚； 分為兩層，上層為水層，下層為酚氯仿混合液。吸取時不要震蕩。17乙醇無水乙醇（2倍體積）沉淀質粒DNA；70%乙醇洗滌質粒DNA沉淀，除去沉淀中的鹽分；1819核酸的定量260 nm，1OD值相當于：雙鏈DNA濃度為50g/ml單鏈DNA濃度為40g/mlA260/A280 = 1.8（DNA）A260/A280 = 2.0（RNA）20電 泳 Electrophoresis 21一、定義電泳帶電粒子在直流電場中向著電性相反電極移動的現(xiàn)象。電泳分析技術利

8、用電泳現(xiàn)象進行物質分離的技術。22二、電泳分析技術發(fā)展概況 1809年 發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象 1937年 Tiselius 自由界面電泳 1948年 Wieland 濾紙電泳 1980年 毛細管電泳 (capiliary electrophoresis)23三、電泳分析技術的分類1.根據(jù)被分離樣品的量多少 分析電泳 制備電泳2.根據(jù)電泳電壓的高低 常壓電泳 0500 V 高壓電泳 5003000V3.根據(jù)電泳中是否使用支持物 自由電泳不使用支持物，在溶液中進行。 區(qū)帶電泳使用支持物244. 按支持物的物理性狀不同濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠

9、、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳粉末電泳，纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳絲狀電泳，如尼龍絲、人造絲電泳255. 按支持物的裝置形式不同平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳266.根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)連續(xù)pH電泳指電泳過程中pH保持不變；不連續(xù)pH電泳指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段也有不同的pH ； 27電泳技術的特點:凡是帶電物質均可應用某一電泳技術進行分離,并可進行定性或定量分析;樣品用量極少;設備簡單;可在常溫進行;操作簡便省時;分辨率高.28四、電泳的基本原理一個分子，如能解離或能吸附帶電質點，在電場中便會向正極或負極移動。 29移動速度以蛋白質分子為例: F= EQ （Q：有效電荷; E

10、：電位梯度） F=6rv （F：摩擦阻力; v：在介質粘度中半徑為r的顆粒的移動速度） F=F EQ=6rv E Q v= 6r 30 遷移率（Mobility)帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。 V Q M = = E 6r 31五、影響電泳速度的因素1.電場強度（E） E電流熱效應支持介質上的水分蒸發(fā)樣品的熱變性 E電泳速度慢延長電泳時間樣品擴散區(qū)帶模糊不清分辨率下降2. 帶點顆粒的半徑 r 阻力電泳速度變慢3. 支持物介質吸附作用；電滲作用；分子篩作用緩沖液 離子強度（I）：I緩沖能力越大緩沖液所載的分電流增加，而樣品所載的電流相應減少電泳速度減慢 pH：pH值決定了化合物解離的程度，

11、也決定了質點所帶的凈電荷。32電泳在一定電場強度下，DNA分子的遷移取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型(相對分子質量不同的DNA片段泳動速度不一樣)，且DNA分子的遷移速度與相對分子質量的對數(shù)值成反比關系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。33瓊脂糖凝膠從瓊脂中除去帶電荷的瓊脂膠后，剩下的不含磺酸基團、羧酸基團等帶電荷基團的中性部分，結構是鏈狀的聚半乳糖，易溶于沸水，冷卻后可依靠糖基間的氫鍵引力形成網(wǎng)狀結構的凝膠。凝膠的網(wǎng)孔大小和凝膠的機械強度取決于瓊脂糖濃度。因此瓊脂糖凝膠可作為分子篩，常用于凝膠層析和電泳。 34電泳鑒定其中超螺旋結構泳動最快；其次為線性結構；最慢的可能是復制中間體（沒