人體外周血淋巴細胞染色體制備與觀察實驗方案

1、實驗方案實驗外周血淋巴細胞培養(yǎng)及染色體標本制備，染色體組型分析一、實驗目的1、了解動物細胞培養(yǎng)的方法。掌握人體外周血淋巴細胞培養(yǎng)與染色體標本制備。2、初步掌握人類染色體G帶的顯示方法及人類染色體G帶在染色體識別中的意義。3、熟悉人類染色體的鏡下檢查和核型分析方法。初步掌握人類染色體G帶的特征及其識別。二、實驗原理所謂外周血培養(yǎng)即是將外周血接種在適當的培培養(yǎng)物中加入適量的秋水仙素，使紡錘體微管解聚，這樣細胞停留在中期，可以獲得大量的分裂細胞。用低滲鹽溶液（一般是0.075mol/L的KC1）處理，使其中的紅細胞及分裂相細胞膜和一部分細胞質除去，最后以氣干法制片，可獲得較好的染色體養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

2、人類外周血細胞本來是終末分化細胞，一般沒有分裂能力，但經PHA（植物血球凝集素）或ConA等藥物刺激后，轉變成可分裂的轉化細胞。染色體顯帶是將染色體標本經過一定程序處理，并用特定染料染色，使染色體沿其長軸顯現明暗或深淺相間的橫行帶紋一一染色體帶，這種技術，稱為染色體顯帶技術。通過顯帶,人們可以準確地識別每一條染色體及染色體上的各個區(qū)段，并可發(fā)現染色體上較細微的結構變化。在所有的顯帶技術中，G顯帶（Gbanding）是最常見的顯帶技術，它是將染色體標本用堿、胰蛋白酶或其它鹽溶液處理后，再用Giemsa染液染色，在普通顯微鏡下，可見深淺相間的帶紋，稱G帶（Gband）。G顯帶方法簡便，帶紋清晰，染

3、色體標本可以長期保存，因此被廣泛用于染色體病的診斷和研究。正常人類染色體的數目為46條（23對），I960年的Denver會議和1963年的London會議制定了統一的人類染色體命名體制：按照染色體的相對長度、臂比和著絲粒指數，將常染色體（22對）按大小用阿拉伯數字標記，順次排列為122號，性染色體用X和Y標記；并按染色體大小和著絲粒位置，把人類染色體分為七個組，用大寫字母AG表示。染色體經顯帶處理后，每條染色體都顯示出其特定的帶紋特征（見下表）。根據這些特征，可以準確地識別每條染色體，檢出染色體數目或結構畸變。表人染色體組型及其特征組別染色體序號形態(tài)，大小著絲點位置次縊痕隨體取大中部著絲粒（

4、，）亞中部著絲粒（）號染色體次大亞中部著絲粒中等亞中部著絲粒號染色體中等近端著絲粒有小中部著絲粒亞中部著絲粒號染色體次小中部著絲粒最小近端著絲粒有、實驗試劑與器材試劑：抗凝劑：肝素溶液（）;培養(yǎng)基：按照說明書配制后抽濾、分裝，凍存?zhèn)溆谩Ｐ∨Ｑ澹菏惺?，冰凍保存，用時在。水浴條件滅活。植物血球凝集素（）：市售，按說明書要求使用抗菌素：青霉素：，鏈霉素：，均用無菌生理鹽水配制中的終濃度均為100U/ml秋水仙素：低滲溶液：氯化鉀固定液：甲醇：冰乙酸（：）胰蛋白酶溶液：用滅菌生理鹽水配制成的胰蛋白酶溶液，用溶液調節(jié)至。染液：磷酸緩沖液（）加原液：用時配制。器材：光學顯微鏡1臺，離心機1臺，恒溫水浴箱

5、1臺，恒溫箱1臺，離心管3支，量簡2個，燒杯2只，培養(yǎng)瓶3個，冷濕載玻片3張，玻片架1臺，注射器1支，碘酒和酒精棉球，酒精燈，1臺，天平1臺，普通冰箱1臺，立式染缸個、染色架個、鑷子個，直頭小吸管支、橡皮吸頭個、吸水紙若干，香柏油，擦鏡紙，剪子個，膠水。正常人類染色體帶核型圖，核型報告紙四、實驗方法（一：培養(yǎng)液配制（在超靜工作臺內無菌操作：每個培養(yǎng)瓶（容積30ml）中加入5ml培養(yǎng)液，其中含：RPMI16404ml滅活小牛血清1mlPHA2.5mg青霉素500U鏈霉素500ug依次將上述試劑加入培養(yǎng)瓶中，反復吹打使其混合均勻，用5%NaHCO3調節(jié)培養(yǎng)基的pH值至7.2-7.4。（二：采血與培

6、養(yǎng)：先以碘酒和75%乙醇消毒皮膚。用2ml滅菌注射器吸取約0.2ml肝素,作靜脈穿刺，抽取外周靜脈血1ml。轉動針筒以混勻肝素常規(guī)消毒后，立即將針頭插入滅菌小瓶內，送入超凈工作臺，在火焰旁將血液滴入23個盛有5ml培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內，每瓶0.20.3ml（6號針頭45度傾斜，約20滴），蓋上橡皮塞，輕輕搖動以混勻。貼好標簽，將培養(yǎng)瓶放在37C恒溫箱內靜置培養(yǎng)72h。（每天搖動培養(yǎng)瓶一次）（三）秋水仙素處理:向經恒溫培養(yǎng)68-72小時的外周血淋巴細胞培養(yǎng)液中加入秋水仙素，使其終濃度為0.4ug/m1,即每瓶（內裝5ml培養(yǎng)基）中用6號針頭傾斜45度角滴4滴，輕輕將液體搖勻，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)2-3小時。

7、（四）標本的制備:1、終止培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物混勻，倒人離心管內，離心沉淀10分鐘（2000r/min）,棄去上清液。2、加入37C預溫的低滲液8m1，輕輕打勻，置37C水浴箱中1520分鐘。（使白細胞膨脹，染色體分散、紅細胞解體。）3、低滲處理完畢后，直接加入新配的固定液1ml進行預固定，混勻后，離心10分鐘（2000r/min）。4、棄去上清液，沿離心管壁緩慢加入固定液4m1，輕輕吹打混勻，置室溫15分鐘。5、離心沉淀2000r/min，10分鐘。6、棄去上情液，再加入固定液4m1吹打均勻重懸細胞，固定10分鐘。7、離心沉淀2000r/min，10分鐘。8、重復固定一次。9、盡量吸凈上清液，視

8、管底剩下的細胞多少加入適量固定液（0.30.6m1）,輕輕吹打成細胞懸液。10、滴片:取保存在冰水中的冷濕載玻片1張，稍傾斜,用滴管吸取細胞懸液，從3040cm高處滴2滴于玻片上，立即用口對準玻片吹氣，使細胞在玻片上散開，然后在酒精燈上略烘一下（勿全烘干，過火3-5次），在空氣中待干。（四）染色:1、常規(guī)制備的染色體標本片室溫放置3天（老化）后（或37C干燥20小時），轉移到80C烤箱內干燥23小時，自然冷卻至室溫后取出；2、將標本片放入盛有胰蛋白酶溶液（預溫至37C）的染色缸中消化（恒溫）。（消化片子時,一般準備23張片子，第一張一般在胰酶緩沖液中浸泡消化35S,而后染色鏡檢，如發(fā)現細胞膨脹

9、得不大，細胞膜沒有破裂，染色體聚集一團伸展不開，可根據具體情況，將消化時間延長13s,而后再染色鏡檢）3、將消化過的標本片立即放入Giemsa染色液中，室溫染色30分鐘;4、自來水輕輕沖洗（沖洗標本片的背面）35秒鐘，晾干；5、鏡下觀察染色體分帶及染色情況。五、實驗結果1、觀察自己制作的標本片中染色體的形態(tài)、顏色及其顯帶情況，記錄并說明原因。計數10個細胞的染色體數。2、試述染色體G顯帶技術在人類染色體識別中的意義。3、繪出一套完整的中期分裂細胞的染色體圖；根據課堂提供的材料，排列初一份正常人類染色體G帶核型圖。4、實驗報告六、注意事項（一）細胞培養(yǎng)技術1、在體外模擬體內的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體

10、中取出的細胞，并使之生存和生長的技術為細胞培養(yǎng)技術。由于體外培養(yǎng)的細胞缺乏機體抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的無菌，防止污染。2、無菌操作的要領和要求1）培養(yǎng)前準備為做好培養(yǎng)前用品的充分準備工作，根據實驗內容的要求收集好已消毒的所需用品，清點無誤后置于超凈工作臺內，這樣可避免操作開始后由于用品不全、往反取物而增加污染機會。2）超凈工作臺消毒打開紫外線殺菌燈照射消毒20-30分鐘，然后關閉紫外燈打開風機，流入的空氣是經過除菌板過濾的空氣，工作臺內可保持無菌環(huán)境。為防止培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)液等受到紫外線照射，消毒前應予先放在帶蓋容器內或在操作時隨手攜入。3）洗手操作時因整個前臂要伸入超凈

11、工作臺內，所以洗手時，一定要洗刷到肘部，然后用0.2%新潔爾滅擦洗或用75%酒精棉球擦試。4）火焰消毒在超凈工作臺無菌環(huán)境中操作時，首先要點燃酒精燈，此后一切操作如安裝吸管橡皮頭、打開或加蓋瓶塞、使用吸管等都要經過火焰燒灼，或在近火焰處進行。注意金屬器械不能在火焰上燒灼時間過長。燒過的用具都要待冷卻后再接觸細胞，否則會燒焦形成炭膜，再用時會把有害物質帶入培養(yǎng)液中。5）操作進行培養(yǎng)操作時動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動增加污染機會。不能用手觸及器皿的消毒部分。如已接觸，要用火焰燒灼消毒或更換。為拿取方便，工作臺面上的用品要有合理布局。原則上是右手使用方便的用品放在右側，左手使用方便的用

12、品放在左側；酒精燈置于中央。培養(yǎng)液等不要過早開瓶，打開的培養(yǎng)液和培養(yǎng)用瓶等應保持斜位或平放，長時間開口直立，易增加落菌機會。吸取各種用液時均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大污染或增加混淆不同細胞的機會。（二）染色體染色體是生物細胞中的一個重要的組成部分，每一物種都有一定數目及一定形態(tài)結構的染色體。染色體能通過細胞分裂而復制。并且在世代相傳的過程中具有穩(wěn)定地保持形態(tài)、結構和功能的特征。染色體是遺傳物質的載體。人類99%的遺傳物質位于染色體上。染色體數目、結構的改變將導致染色體病。（三）操作i接種的血樣越新鮮越好，最好是在采血后24h內培養(yǎng)，如不能立刻培養(yǎng)，應置于4C冰箱存放，避免保存時間過久，

13、以免影響細胞的活力。培養(yǎng)過程中，如發(fā)現血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕震蕩，使凝塊散開，繼續(xù)放回3C恒溫箱內培養(yǎng)，最好每天輕輕震蕩混勻一次。2Giemsa為噻嗪類染料，其堿性成份天青B與DNA分子中的磷酸基結合，蛋白質在一定的環(huán)境中,具有不同的嗜酸性和嗜鹼性傾向,出現著色差異易于觀察。因此染液PH值對著色效果有影響。當呈淡灰色帶紋不顯時，應調節(jié)染液pH值7.07.2,復染lOmin,可獲得鮮亮的顯色效果。3、在采血接種培養(yǎng)是，不要加入太多的肝素。肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴細胞的轉化和分裂。但肝素量也不應太少，以免發(fā)生凝血或培養(yǎng)物中出現纖維蛋白形成的膜狀結構。這種膜狀物一般在培養(yǎng)24小時左右出現，此

14、時可在無菌條件下將它除去以免影響培養(yǎng)效果。4、在普通培養(yǎng)箱內培養(yǎng)時，必須將培養(yǎng)瓶口蓋緊，以免培養(yǎng)液的PH發(fā)生較大的變化。如果培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液酸化比較嚴重（培養(yǎng)液呈黃色時）將不利于細胞生長，此時可加入適量無菌的0.14%碳酸氫鈉溶液調整或再加入23ml培養(yǎng)液來校正。培養(yǎng)箱的溫度應控制在37C+0.5C，溫度過高或過低都會影響細胞的生長。5、染色體標本質量不佳的原因。如果淋巴細胞轉化試驗表明培養(yǎng)物生長發(fā)育良好，但制成的標本質量不佳時，其原因可能為：秋水仙素處理不當：一般秋水仙素溶液的濃度與處理時間有一定的關系，如果處理時間太短，則標本中的分裂細胞就少，相反，如果處理時間太長，則標本中的分裂細胞雖

15、多，但其染色體縮得太短，以致形態(tài)特征模糊，不容易觀察。低滲處理不當：低滲處理細胞時間過長，細胞膜往往過早破裂，以致分裂細胞或染色體丟失；如果處理時間不足時，細胞膨脹不夠，則染色體分散不佳，難以進行染色體計數分析。離心速度不合適：如果從培養(yǎng)瓶收集細胞后進行離心時的速度太低，細胞可能被丟失；如果細胞被低滲后離心速度過高，往往使分裂細胞過早破裂，分散良好的分裂相丟失，以致制出的標本分裂相較少或大部分為剩余的分散不好的分裂相。標本固定不充分：如固定液不新鮮，甲醇、冰醋酸的質量不佳，此時染色體形態(tài)模糊、不分散，其周圍有細胞漿的藍色背景。載玻片清洗不徹底：玻片有油跡，致使滴在載玻片上的細胞懸液不能均勻分散

16、，且細胞隨液體流動而丟失。載玻片冷凍不夠：合適的冰濕玻片，從冰水中拿出時，其表面有一層霜雪。如冷凍不夠則無此現象，此時細胞難以貼附在載玻片上。6、下列因素對染色體G顯帶有一定的影響。（1）胰蛋白酶溶液的濃度，是決定染色體消化時間的關鍵因素之一。濃度高時，消化時間短，但極易消化過，故一般消化時間不宜少于10秒鐘。（2）胰蛋白酶溶液的溫度：溫度較高時，酶解反應速度較快。在有空調的實驗室中，最合適的溫度是室溫。在進行顯帶之前，胰蛋白酶溶液應當在室溫至少穩(wěn)定30分鐘。對無空調控溫的實驗室，也有把胰蛋白酶溶液溫度穩(wěn)定在4C的，有的甚至置冰箱中進行處理。在溫度較低的情況下，應當延長處理時間。如能把所有條件穩(wěn)定下來，則可得到一致的效果。胰蛋白酶溶液中的鹽類成分：溶液中的二價陽離子會使反應減慢，但不能阻止反應。制作標本的方法：火焰干燥法制得的標本對胰蛋白酶處理的抵抗性較氣干法標本要強些。二0標本的片齡：標本保存的時間越長，染色體對胰蛋白酶處理的抵抗性越大。片齡超過20天以上的標本顯帶時，染色體往往呈斑點狀，而不是顯示帶紋。染色：隨著染色時間的延長，在染液表面會形成一層氧化膜(發(fā)亮)。染色完畢，應把標本浸入水中洗去染液，或用自來水直接沖去染液。如直接傾去舊染