白藜蘆醇體外抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

1、白藜蘆醇體外抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的:討論白藜蘆醇(resveratrl，Res)體外對(duì)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞增殖的影響，并討論其初步機(jī)制。方法:采用四甲基氮唑藍(lán)法TT檢測(cè)Res處理后IAPaa-2細(xì)胞的增殖情況。用倒置顯微鏡、透射電鏡觀察Res處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res分別作用48h后IAPaa-2細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:Res體外能明顯抑制IAPaa-2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，且在一定范圍內(nèi)呈時(shí)間、濃度依賴性。經(jīng)Res處理后，倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞數(shù)目減少，局部細(xì)胞變圓，核濃縮，提示可能存在細(xì)胞凋亡；電鏡證實(shí)

2、存在典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。用25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)出各處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論:Res在體外能明顯抑制IAPaa-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡可能是Res抑制IAPaa-2細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】白藜蘆醇胰腺癌增殖凋亡Abstrat:bjetive:Texplretheeffetfresveratrl(Res)ntheprliferatinfpanreatiarinaIAPaa-2ellsinvitrandexplretherudientalehanis.ethds:ethylthia

3、zlyltetrazliuethd(TT)asusedtdetettheellgrthstatusfIAPaa-2ellsaftertreatentithRes.TherphlgihangesfellsaftertreatentithReseredetetedbyinvertedirspeandtransissineletrnirspe.Theapptsisratesereanalyzedithflytetry(F)aftertheellseretreatedith25lL-1,50lL-1,100lL-1and200lL-1Resfr48h,respetively.Results:Resin

4、hibitedtheprliferatinfIAPaa-2ellsinanentratin-andtie-dependentanneraseasuredbyTTethd.AftertheellseretreatedithRes,invertedirspebservedtheredutinftheellnuberandfundsignifiantrphlgihanges,haraterizedbyellrundingandellnulearenrihentsuggestingapptsis.Andthepreseneftypialrphlgialhangesfapptsisasnfiredith

5、transissineletrnirspe.Theapptsisratesat25lL-1,50lL-1,100lL-1and200lL-1Res-treatedgrupsaftertreatentfr48h,easuredbyF,eresignifiantlyhigherthanthseinntrlgrups(P0.05).nlusin:ThesefindingssuggestthatthenaturalprdutResayhaveaptentanti-prliferativeeffetnIAPaa-2ells,theehanissfhihayberelatedttheindutinfapp

6、tsis.Keyrds:resveratrl;panreatiarina；prliferatin；apptsis胰腺癌是一種惡性程度很高的消化道腫瘤,在美國(guó)居癌癥死因的第4位1，在我國(guó)其發(fā)病率也有上升趨勢(shì)。胰腺癌由于早期臨床表現(xiàn)隱匿，相當(dāng)局部病人就診時(shí)已屬晚期，手術(shù)根治性切除率只有25%左右2，所以多數(shù)病人只能采用化療、放療等姑息性治療手段，然而現(xiàn)有化療藥物,即使包括吉西他濱在內(nèi)，對(duì)胰腺癌的治療效果均欠佳。白藜蘆醇(resveratrl，Res)是一種多酚類(lèi)化合物，在我國(guó)中藥植物虎杖鮮根中有較高的含量3，近年研究發(fā)現(xiàn)Res對(duì)胃癌、乳腺癌等具有顯著體外增殖抑制作用4，5，因此，Res有望成為治療

7、腫瘤的新藥。目前關(guān)于Res和胰腺癌治療方面的研究甚少，因此我們選擇Res和胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察Res對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響，來(lái)初步討論Res用于胰腺癌治療的可能性。1材料和方法1.1細(xì)胞株與試劑人胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞株購(gòu)自湖南遠(yuǎn)泰生物公司。Res購(gòu)自美國(guó)Siga公司，純度99.9%，用二甲基亞砜(diethylsulphxide，DS)溶解，配成400lL-1貯存液，消毒后，分裝，于-20凍存?zhèn)溆?。噻唑藍(lán)(TT)和DS均為美國(guó)Ares公司產(chǎn)品，處理細(xì)胞時(shí)，DS濃度0.1%(實(shí)驗(yàn)證實(shí)該濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響)。DE培養(yǎng)基(DulbedifiedEagleediu

8、)、0.25%胰酶為美國(guó)GIB公司產(chǎn)品，碘化丙啶(prpidiuidine，PI)為美國(guó)Siga公司產(chǎn)品。1.2細(xì)胞培養(yǎng)人胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞在5%2，37條件下，用含10%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100Ul-1青霉素、100gl-1鏈霉素的DE培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至70%80%交融時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。1.3TT法檢測(cè)Res處理后IAPaa-2細(xì)胞的增殖抑制率胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/l，重新接種到96孔培養(yǎng)板上，約1104/孔，于37過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞約70%交融。然后，將細(xì)胞分Res處理組、溶劑對(duì)照組及空

9、白對(duì)照組：Res組分別換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液100l；溶劑對(duì)照組換用100l含與Res相應(yīng)濃度DS的培養(yǎng)液；含100l培養(yǎng)液(不含細(xì)胞與藥物)孔板作為空白對(duì)照組。每組設(shè)3復(fù)孔。分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，參加TT(5gl-1)20l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，去上清，參加DS100l/孔，室溫振蕩10in，上酶標(biāo)免疫測(cè)定儀檢測(cè)，492n波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值(absrbane，A)。比色時(shí)，空白組調(diào)零。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=(1-處理組A/溶劑對(duì)照組A)100%。繪制不同時(shí)間濃度-抑制率曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4形

10、態(tài)學(xué)觀察1.4.1倒置光學(xué)顯微鏡觀察：胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1105/l，重新接種到96孔培養(yǎng)板上，為1104/孔，于37過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞約70%交融。將細(xì)胞分Res組和對(duì)照組：Res組分別換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液100l，對(duì)照組含不加藥物培養(yǎng)液100l。于5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48hr后，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變并攝片。1.4.2透射電鏡觀察：胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，接種到6孔培養(yǎng)板上，于37過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞約70%

11、交融。將細(xì)胞分Res組和對(duì)照組：Res組換用含25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res的培養(yǎng)液，對(duì)照組含不加藥物培養(yǎng)液。5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48h后，分別搜集對(duì)照組、Res處理組的細(xì)胞，送湘雅醫(yī)學(xué)院電鏡中心檢測(cè)。1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞用0.25%胰酶消化后，重新接種到6孔培養(yǎng)板上，于37過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞約70%交融。將細(xì)胞分Res組和對(duì)照組：Res組換用含不同濃度Res(25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1)的培養(yǎng)液，對(duì)照組含不加藥物培養(yǎng)液。5%2、37條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)48h后，搜集對(duì)照組

12、、25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理組細(xì)胞(1106)，加預(yù)冷70%乙醇固定過(guò)夜，用PI染色。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，ultiyle軟件分析結(jié)果。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法單處理因素組間多樣本均數(shù)的多重比擬采用單因素方差分析,并用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)展樣本均數(shù)間兩兩比擬；多處理因素采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，并用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)展樣本均數(shù)間兩兩比擬，用SPSS10.0軟件分析結(jié)果。2結(jié)果2.1TT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率分別用25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1處理IAPaa-2細(xì)胞12h、24h、48h、72h后，酶標(biāo)儀測(cè)定A值結(jié)果后,計(jì)算增

13、殖抑制率，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)圖1。用兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析后，結(jié)果顯示：不同濃度Res對(duì)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞增殖抑制率不同(F=526.12，P=0.000)；Res不同作用時(shí)間對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖抑制率不同(F=805.27，P=0.000)。并用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)展樣本均數(shù)間兩兩比擬，結(jié)果分析示：除100lL-1與200lL-1分別處理12h或72h抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組在同一時(shí)間或同一濃度范圍內(nèi)，組間兩兩差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?？梢?jiàn)Res體外對(duì)IAPaa-2細(xì)胞有明顯抑制作用,且在一定范圍內(nèi)根本上呈濃度、時(shí)間依賴性。2.2形態(tài)學(xué)觀察2.2.1倒置光學(xué)顯微鏡：對(duì)

14、照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞充分生長(zhǎng)，透光度好。25lL-1Res外理IAPaa-2細(xì)胞48h后，倒置顯微鏡觀察見(jiàn)極少量細(xì)胞變圓，核濃縮，隨著藥物作用濃度的增加，核濃縮細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)目減少，提示可能存在細(xì)胞凋亡，詳見(jiàn)圖2。2.2.2透射電鏡觀察：對(duì)照組細(xì)胞核大，圓形或橢圓形，形態(tài)較規(guī)那么，染色質(zhì)分布均勻,胞漿內(nèi)有豐富的細(xì)胞器(見(jiàn)圖3A)。25lL-1Res處理48h后，電鏡下見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞體積縮小，內(nèi)容物濃縮，核體積變小，染色質(zhì)聚集變粗，成塊靠邊，細(xì)胞器濃縮，細(xì)胞外表有突起，但細(xì)胞膜尚完好(見(jiàn)圖3B)；隨著藥物濃度增大,電鏡示細(xì)胞染色質(zhì)更加密集，核碎裂增多及大量典型凋亡小

15、體產(chǎn)生(見(jiàn)圖3、圖3D)。結(jié)果見(jiàn)圖3。2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率結(jié)果示對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.400.50)%，25lL-1、50lL-1、100lL-1、200lL-1Res處理48h后細(xì)胞凋亡率分別為(4.601.25)%，(12.770.825)%，(23.402.50)%，(25.402.46)%，詳見(jiàn)表1。各組均數(shù)比擬的單因素方差分析得F=107.50，P=0.000，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)展樣本均數(shù)間兩兩比擬示各處理組與對(duì)照組之間差異具有顯著性(P0.05)，25lL-1、50lL-1、100lL-1Res處理組凋亡率兩兩差異皆有顯著性(P0.05)，而100lL-1與200lL-1R

16、es處理組之間凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3討論3.1Res的分子構(gòu)造及生物學(xué)作用Res的化學(xué)名為芪三酚(3，5，4-trihydrxystibene)，分子式是14H123，相對(duì)分子量為228.25，屬于非黃酮類(lèi)多酚化合物，于1940年首次從毛葉藜蘆(veratrugrandiflru)的根局部離獲得。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Res廣泛存在多種植物中，以中藥植物虎杖中含量較為豐富。研究還證實(shí)，Res對(duì)人體具有調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、防止低密度脂蛋白氧化、去除自由基、抑制血小板聚集、保護(hù)心腦血管和抗炎、抗過(guò)敏與抗腫瘤等多種藥理作用6；而且，Res為天然化合物,無(wú)毒副作用,故其藥用價(jià)值極大，已引起了全世界科研人員的

17、高度關(guān)注。本研究通過(guò)觀察Res對(duì)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞體外增殖的影響并討論其初步機(jī)制,旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該藥的藥理作用，為進(jìn)一步利用開(kāi)發(fā)該類(lèi)藥物提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。3.2Res對(duì)IAPaa-2細(xì)胞的增殖的影響腫瘤對(duì)藥物敏感的實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩種，體外實(shí)驗(yàn)是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基矗本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TT法檢測(cè)到Res對(duì)IAPaa-2細(xì)胞有顯著增殖抑制作用，25lL-1Res對(duì)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞增殖抑制作用已經(jīng)相當(dāng)明顯，作用72h平均抑制率已達(dá)29.48%；當(dāng)濃度進(jìn)步到200lL-1時(shí)，作用24h、48h、72h其平均抑制率分別為45.41%，58.17%，76.04%。可見(jiàn)Res對(duì)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞

18、的增殖抑制作用根本上呈時(shí)間、濃度依賴性。本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步為Res體外對(duì)IAPaa-2細(xì)胞的增殖抑制作用提供形態(tài)學(xué)支持并討論其初步作用機(jī)制，采用倒置顯微鏡和透射電鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)展了觀察，結(jié)果證實(shí)Res作用后，胰腺癌細(xì)胞數(shù)目減少，并存在明顯的細(xì)胞凋亡。而且，25lL-1、50lL-1、100lL-1Res組凋亡率呈濃度依賴性(P0.05)(100lL-1與200lL-1Res處理組之間凋亡率無(wú)差異可能是因?yàn)榇罅縍es作用后局部凋亡細(xì)胞出現(xiàn)自溶或繼發(fā)壞死,導(dǎo)致凋亡細(xì)胞比例不再增加)。綜上所述，Res體外可顯著抑制胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡是Res抑制胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞增殖的重要機(jī)制，且誘導(dǎo)凋亡作用呈濃度依賴性。凋亡是細(xì)胞自身調(diào)節(jié)的一個(gè)程序性死亡過(guò)程，它不引起炎癥反響，機(jī)體亦不會(huì)因此而引發(fā)不良現(xiàn)象。Res誘導(dǎo)胰腺癌IAPaa-2細(xì)胞凋亡進(jìn)一步說(shuō)明，它對(duì)治療胰腺癌可能有著很好的應(yīng)用前景；而且，由于Res是天然化合物,在自然界分布極廣，目前體內(nèi)實(shí)驗(yàn)又未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用,為理想的天然抗癌藥物。目前有關(guān)Res抗癌作用的機(jī)制研究進(jìn)展很快，但多數(shù)還限于實(shí)驗(yàn)室階段，如能徹底理解其抗癌機(jī)制，將會(huì)使該藥物有更廣闊的臨床