微囊藻毒素LR促肝癌過程p53、p16基因mRNA表達(dá)

1、微囊藻毒素LR促肝癌過程p53、p16基因mRNA表達(dá)胡志堅,陳華,龐春艷,鄭玲,林奇英【關(guān)鍵詞】藻毒素類;,摘要:目的討論微囊藻毒素LR(LR)促肝癌的分子機(jī)制。方法采用二階段致癌理論建立中期試驗動物模型,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GT)染色檢驗LR的促癌作用,并以RTPR結(jié)合圖像分析技術(shù)準(zhǔn)確測定大鼠肝臟p53和p16基因的表達(dá)情況。結(jié)果(1)LR在促大鼠肝癌過程中能顯著增加GT陽性率。(2)LR在促大鼠肝癌過程中能顯著增加大鼠肝臟p53RNA表達(dá)強(qiáng)度,而對p16RNA表達(dá)強(qiáng)度沒有影響。結(jié)論調(diào)節(jié)p53表達(dá)可能是LR促癌過程的重要機(jī)制。關(guān)鍵詞:藻毒素類;谷氨酰轉(zhuǎn)移酶;毒素類;基因,p53;基因,p16;肝

2、腫瘤ABSTRAT:bjetiveTexplretheleularehanisfirystinLR(LR)induingflivertur.ethdsArdingtstageediutertherytsetuptheanialdel,andbiheistrytehniquetdetetthearingenesisfthedel.RTPRtehniqueandiageanalysisereusedtstudytheRNAexpressinfthep53andp16intheursefinduingtur.Results(1)LRanenhanethepsitivereatinfGT.(2)LRi

3、nreasedtheexpressinfp53,andhaventeffetntheexpressinfp16.nlusin(1)aninduedliverturfratinstrngly.(2)Thehighexpressinfp53ayplayaniprtantrleinthearingenesisfLRinliver.KEYRDS:irystins;glutayltransferase;txins;genes,p53;genes,p16;liverneplass當(dāng)前隨著全球環(huán)境的不斷惡化,水體中有毒的藻類對人類安康的影響也越來越受人們的關(guān)注。飲水中以微囊藻毒素(irystin,)為代表的

4、藻類毒素已被公認(rèn)為引起肝癌的三大主要環(huán)境因素之一1。是一種特征性的肝毒素,其中以分布廣且肝毒性明顯的微囊藻毒素LR(LR)為其主要代表物。已有研究說明,福建同安肝癌高發(fā)與存在LR有關(guān)2。許多研究說明，基因表達(dá)的改變與腫瘤發(fā)生親密相關(guān),為進(jìn)一步理解LR在肝腫瘤發(fā)生過程中的作用和機(jī)制,筆者選擇與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期親密相關(guān)的p53和p16基因進(jìn)展研究,通過分析它們在藻類肝毒素促肝癌過程RNA表達(dá)的變化,從而進(jìn)一步明確LR的促癌的機(jī)制。1材料和方法1.1材料1.1.1動物istar大鼠(中科院上海實(shí)驗動物中心;合格證號:中科動管第005號)5周齡,雄性,45只。1.1.2試劑二乙基亞硝氨(DEN,南京土壤研

5、究所),200g/kg腹腔注射。LR純毒素(美國Siga公司),20g/kg腹腔注射。RNA提取用TrizlRNA提取試劑盒(美國Invitrgen公司),DNA合成用試劑盒(SuperSriptTFirstStrandSynthesisSysternfrRTPR,美國Invitrgen公司)。L谷氨酰萘胺、雙甘氨肽和固漿紫(上?；瘜W(xué)試劑公司)。1.1.3藻水在9月份藻類繁殖頂峰時用25號浮游生物網(wǎng)采集福建同安汀溪水庫的藻細(xì)胞,經(jīng)鏡檢60%為微囊藻。培養(yǎng)基培養(yǎng),取其培養(yǎng)液作樣本,經(jīng)上海第一醫(yī)科大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所ELISA法檢測,該藻水中含529.656ng/L。1.2方法1.2.1二階段試驗大

6、鼠隨機(jī)分成4組,正常飼養(yǎng)1周后,3組給予DEN200g/kg腹腔注射1次,1組等容量生理鹽水腹腔注射(空白對照組)。第3周末,4組大鼠均行2/3肝切除。第410周,DEN+純毒素組LR純毒素20g/kg腹腔注射,DEN對照組和DEN+藻水組等容量生理鹽水腹腔注射。在此期間,DEN+藻水組飲用藻水,另3組飲用自來水。DEN對照組與DEN+純毒素組各1只死亡。第10周末處死動物,取肝臟做HE染色、GT染色和RTPR。1.2.2GT染色取L谷氨酰萘胺和雙甘氨肽各20g溶解于0.1l/L(pH7.2)磷酸緩沖液16L作為甲液;稱取固漿紫24g溶解于生理鹽水24L作為乙液。甲乙兩溶液混合過濾制備成染液,

7、將染液倒入染色缸并置于37水浴10in,將冷凍肝組織切片與水浴中的染液作用3060in,取出用蒸餾水清洗,然后在2%uS4浸洗2in,蒸餾水再次漂洗。最后蘇木精染色,甘油明膠封固。以正常小鼠腎臟作陽性對照,在光鏡下觀察肝細(xì)胞漿,以染成桔紅色為陽性。1.2.3反轉(zhuǎn)錄聚合酶反響以組織標(biāo)本100gTrizlT1L的比例將肝癌組織溶于TrizlT中,立即于室溫研磨混勻,參加氯仿200L劇烈震蕩15s,室溫下靜置23in,于4、7000r/in離心15in。提取上清即為肝癌組織的總RNA,經(jīng)SuperSriptTrizlTRT反轉(zhuǎn)錄為DNA。取DNA2L于25L反響體系中進(jìn)展PR反響(引物與條件見表1)

8、。每個反響包括不加DNA模板的陰性對照。PR反響完成后,取PR產(chǎn)物510L進(jìn)展電泳鑒定,于1.5%2%瓊脂糖凝膠,10V/凝膠的電壓下電泳。凝膠成像系統(tǒng)拍照,IagePrPlus圖像分析軟件對目的基因及內(nèi)參物電泳條帶進(jìn)展積分光密度(integralptialdensity,ID)測定,用目的基因吸光度與GAPDH光密度比值代表目的基因的相對表達(dá)含量。表1PR擴(kuò)增引物略1.3統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS12.0統(tǒng)計軟件的準(zhǔn)確概率法、方差分析、LSD法對數(shù)據(jù)分析。2結(jié)果2.1肝組織病理形態(tài)改變各組肝臟外表光滑,經(jīng)2/3切肝后,剩余肝葉均代償性增大至接近原肝臟體積。純毒素組肝邊緣稍有變純,質(zhì)地變硬,體積略

9、校鏡下見:純毒素組肝臟內(nèi)出現(xiàn)大小不一的嗜酸、透明、混合肝細(xì)胞增生灶,灶內(nèi)肝細(xì)胞混濁腫脹,有水樣變性及點(diǎn)狀壞死,還可見少量雙核、核深染、巨核肝細(xì)胞。個別區(qū)域間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(圖1);DEN對照組和DEN+藻水組病灶數(shù)明顯低于DEN+純毒素組;空白對照組未見組織學(xué)改變。2.2LR對肝臟的促癌作用各組GT染色的陽性率有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。組間兩兩比擬(準(zhǔn)確概率法)結(jié)果顯示,DEN+純毒素組GT染色的陽性率顯著地高于其他組(P0.05),說明純毒素對肝癌的發(fā)生具有促進(jìn)作用。DEN+藻水喂養(yǎng)組雖然GT陽性率比DEN對照組高,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05,表2)。表2各組谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶染色結(jié)果略2.3L

10、R對肝臟p53、p16RNA表達(dá)的影響利用ANVA(各組間的方差齊)對各組各指標(biāo)均數(shù)進(jìn)展檢驗：(1)p53RNA表達(dá)強(qiáng)度各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.532,P0.01)。利用LSD法對各組均數(shù)之間進(jìn)展兩兩比擬,DEN+純毒素組RNA表達(dá)強(qiáng)度高于其他3組,且有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其他各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;(2)p16RNA表達(dá)強(qiáng)度的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。表3各組p53、p16RNA的表達(dá)略3討論3.1LR在動物肝癌前病變模型中的作用按二階段致癌理論設(shè)計的中期動物試驗?zāi)Ｐ褪且环N評價環(huán)境化合物的致癌或促癌作用有效動物模型,這一測試模型是It等經(jīng)過長期的探索后才得以建立3。本次研究中LR

11、是在DEN啟動下并經(jīng)2/3肝切除激活肝細(xì)胞增殖后,進(jìn)展染毒,其作用階段為肝癌的促進(jìn)階段。顯微鏡下觀察GT組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示(1)HE染色:純毒素組肝組織普遍存在有病變程度不同的嗜酸、透明、混合肝細(xì)胞增生灶。DEN對照組、DEN+藻水喂養(yǎng)組雖也可觀察到病灶,但數(shù)量和大小都比DEN+純毒素組少,病變的強(qiáng)度也較輕?？瞻讓φ战M肝臟未見明顯的損傷,說明LR可增加肝臟的受損程度;(2)GT是屬于轉(zhuǎn)移酶類,在體內(nèi)的主要的功能是參與“谷氨酰循環(huán),能催化谷氨酰半胱氨酰甘氨酸三肽中的肽鏈水解。GT與組織的氨基酸和肽的調(diào)節(jié)、分泌、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、合成有關(guān)。主要分布于腎、肝、腸、胰等。GT在正常情況下大鼠的肝臟經(jīng)GT染

12、色成陰性,在胎肝、肝癌發(fā)生時表達(dá)增強(qiáng),是目前公認(rèn)的肝癌癌前病變的指標(biāo)4。本次實(shí)驗結(jié)果DEN+純毒素組GT陽性率顯著高于其他組,而且在病變灶中染色特別深,說明LR可顯著增加DEN+純毒素組GT染色陽性率,進(jìn)一步證實(shí)了LR具有明顯的促肝癌作用。同時也證明了本模型建立是成功的。在實(shí)驗中,DEN+藻水組尚未明顯表現(xiàn)出其促癌作用原因可能有兩方面,一方面藻水中的毒素含量遠(yuǎn)低于DEN+純毒素組,另一方面其染毒的途徑是經(jīng)口,而文獻(xiàn)報道經(jīng)口的毒性只是腹腔注射的1/305,故在中期模型中尚不能顯示出其明顯促癌效應(yīng),但也可看出該組GT陽性率已有增高趨勢。3.2LR的促癌機(jī)制細(xì)胞周期的調(diào)控失衡是癌變的一個作用機(jī)制,其

13、中G1/S期的轉(zhuǎn)換是細(xì)胞周期中比擬敏感的時期,易受內(nèi)外因素的影響,導(dǎo)致細(xì)胞周期的改變,決定繼續(xù)增殖還是退出細(xì)胞周期。因此本課題針對調(diào)控細(xì)胞周期起決定性作用的p53和p16RNA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)展研究。p53位于人染色體17pl3,野生型p53通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤的作用。但突變型p53那么喪失上述功能,并且局部突變型p53獲得促增殖、轉(zhuǎn)化致癌潛能,并能抑制細(xì)胞凋亡。正常情況下p53蛋白以潛在形式存在并維持低程度。當(dāng)DNA受損時,p53即被活化表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)一步通過直接或間接影響其下游p21af1基因和細(xì)胞周期素依賴性激酶(DK)表達(dá),使細(xì)胞周期停滯,以便進(jìn)展DNA修復(fù),假設(shè)修復(fù)失

14、敗那么細(xì)胞凋亡6。筆者研究結(jié)果顯示,DEN+純毒素組p53RNA表達(dá)強(qiáng)度顯著高于其他組,可能是由于毒素對DNA的損傷,從而促使p53表達(dá)增強(qiáng),也有可能這種表達(dá)的增強(qiáng)是由于p53受毒素的損傷而發(fā)生突變引起的。p16又稱為多種腫瘤抑制基因,其作用是通過抑制DK4活性或DK4與ylin復(fù)合物的活性,使之不能解除pRb基因?qū)D(zhuǎn)錄因子的抑制作用,從而使細(xì)胞停滯在G1期而不進(jìn)入S期,到達(dá)其負(fù)向調(diào)控作有,有利于受損的DNA的修復(fù)7。但在筆者研究中p16的RNA表達(dá)各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示LR在促肝癌過程中對p16RNA表達(dá)可能無影響。參考文獻(xiàn)：1俞順章,董傳輝,張幼辰.我國兩種生物毒素與肝癌黃曲霉毒素與

15、藻類毒素J.衛(wèi)生研究,1998,27(增刊):84.2孫興盛,陳華,薛常鎬,等.同安水環(huán)境藻類及藻類毒素分布調(diào)查J.中國公共衛(wèi)生,2000,16(2):147148.3ItN,TaanS,ShiraiT.AediuterratliverbiassayfrrapidinvivdetetinfaringeniptentialfheialsJ.anerSi,2022;94(1):38.4沈衛(wèi)東,黃介飛.肝癌特異性GGT診斷肝癌的研究進(jìn)展J.世界華人消化雜志,2022,13(9):11191122.5FaellJK,ithellRE,EverettDJ,etal.Thetxiityfyanbaterialtxinsintheuse:IirystinLRJ.HuExpTxil,1999