HCV復(fù)制子復(fù)制效率的影響因素及意義

1、HCV復(fù)制子復(fù)制效率的影響因素及意義【關(guān)鍵詞】,肝炎病毒【關(guān)鍵詞】肝炎病毒,丙型；復(fù)制子；變異(遺傳學(xué))；細(xì)胞容受性0引言自1989年丙型肝炎病毒hepatitisvirus，HV發(fā)現(xiàn)以來，HV體外細(xì)胞模型研究一直是HV研究的熱點(diǎn)問題之一，能在人肝癌細(xì)胞系中高程度自主復(fù)制的HV復(fù)制子系統(tǒng)的出現(xiàn)，大大加強(qiáng)了HV體外復(fù)制機(jī)制的研究.至1999年復(fù)制子模型系統(tǒng)被首次描繪以來，這個(gè)系統(tǒng)逐步得到了完善.特別是細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異及宿主細(xì)胞容受性這兩個(gè)能明顯增強(qiáng)HV體外復(fù)制才能的重要因素的發(fā)現(xiàn)，拓展了復(fù)制子系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域，如瞬時(shí)復(fù)制系統(tǒng)、選擇性全長基因組及根底研究和抗病毒藥物挑選所需各種新型復(fù)制子的構(gòu)建.最

2、終，復(fù)制子系統(tǒng)將有助于詮釋干擾素抗性的分子根底.我們就復(fù)制子的適應(yīng)性變異和細(xì)胞容受性問題進(jìn)展綜述.1細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異1.1細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異區(qū)域適應(yīng)性變異現(xiàn)象1-2最初是通過在G418挑選的細(xì)胞克隆內(nèi)復(fù)制的HVRNA序列分析而發(fā)現(xiàn)的，在多種情況下，發(fā)現(xiàn)一個(gè)特定細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的復(fù)制子RNA分子群體內(nèi)，HV編碼區(qū)至少可見一個(gè)位點(diǎn)變異，致一個(gè)氨基酸替代，而該氨基酸的替代在這個(gè)細(xì)胞克隆中所有RNA分子間是很保守的，盡管每一個(gè)HV非構(gòu)造蛋白都可見這種“保守性變異，它們集中于某些特定的區(qū)域.主要集中區(qū)域位于NS5A絲氨酸該蛋白高度磷酸化所需氨基酸富集的中心區(qū)域，研究顯示該區(qū)域絲氨酸殘基常被替代S2197，S

3、2201，S22043，而NS5A高度磷酸化在控制HVRNA復(fù)制過程中起著關(guān)鍵的作用4，但迄今尚不清楚NS5A磷酸化的改變?nèi)绾斡绊慠NA復(fù)制.第二個(gè)適應(yīng)性變異集中區(qū)域發(fā)生于NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的羧基端及NS3螺旋酶的氨基端3,5，三維構(gòu)造顯示大多數(shù)變異位于溶媒可接近的分子外表，在螺旋酶區(qū)域內(nèi)，變異似乎限于一個(gè)特定的外表，研究顯示HVNS3螺旋酶的RNA解鏈活性是RNA復(fù)制所必須的6，而該區(qū)域的變異對(duì)復(fù)制功能的影響需進(jìn)一步研究.第三個(gè)適應(yīng)性變異集中區(qū)域見于NS4B的兩個(gè)非常獨(dú)特的位點(diǎn)3,7，基于NS4B的拓?fù)淠Ｐ?，在K1846T位氨基酸發(fā)生替代的情況下，這兩個(gè)位點(diǎn)位于與透膜區(qū)2和3連接的胞質(zhì)環(huán)

4、上，在1897位氨基酸發(fā)生替代的情況下，那么位于透膜區(qū)4的胞質(zhì)羧基端，在T2傳代HV基因組復(fù)制子中7，還發(fā)現(xiàn)1897位苯丙氨酸替代纈氨酸，這個(gè)基因組是HV感染T2細(xì)胞克隆的共有序列并經(jīng)歷了屢次傳代，說明同樣的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異發(fā)生于不同的HV別離株.最近，對(duì)長期細(xì)胞培養(yǎng)1218中，HV復(fù)制子的基因變異及復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)制子的基因變異呈現(xiàn)時(shí)間依賴性的累積，變異率約為每年每個(gè)位點(diǎn)3.010-3堿基替代，復(fù)制子的基因離散度diversity也隨時(shí)間擴(kuò)大，來自不同時(shí)間點(diǎn)的復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞提醒隨時(shí)間累積的基因變異明顯改善克隆形成效率8.1.2適應(yīng)性變異對(duì)HV復(fù)制的影響最初，將一些細(xì)胞培

5、養(yǎng)適應(yīng)性變異插入親代復(fù)制子中，定量轉(zhuǎn)染后測定G418抗性集落的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)特定區(qū)域變異的插入致集落形成效率增加，NS5A區(qū)某些變異的插入，集落形成效率較親代增加1104倍1.功能性挑選檢測發(fā)現(xiàn)高效率的復(fù)制子常有多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生適應(yīng)性變異.目前，有4個(gè)HV別離株的復(fù)制子系統(tǒng)即：n19，HVN10，H771及JFH111序列.HVN與JFH1序列不需要適應(yīng)性變異即能在Huh7細(xì)胞中有效復(fù)制，實(shí)驗(yàn)證明NS5A區(qū)4個(gè)氨基酸SSYN的插入與HVN序列的有效復(fù)制有關(guān).H77序列復(fù)制子至少需要兩個(gè)適應(yīng)性變異1,5，S2204I，A1226D或P1496L，含有P1496L及S2204I的復(fù)制子較僅含有S2204L

6、復(fù)制子的復(fù)制效率高3104倍，而含有A1226D及S2204I的復(fù)制子較僅含有S2204L復(fù)制子的復(fù)制效率高800倍；僅含有P1496L復(fù)制子較含有P1496L及S2204I的復(fù)制子的復(fù)制效率低250倍，說明P1496L結(jié)合S2204I適應(yīng)性變異是有效的H77復(fù)制子復(fù)制所必需的.n1復(fù)制子的適應(yīng)性變異研究較深化，發(fā)現(xiàn)了一系列的適應(yīng)性變異位點(diǎn)2,3，其中，NS5B區(qū)R2884G適應(yīng)性變異效率最高.在n1復(fù)制子的研究中還證明了復(fù)制子的高程度復(fù)制無細(xì)胞毒性作用.此外，Lhann等3發(fā)現(xiàn)兩個(gè)高度適應(yīng)性變異位點(diǎn)的組合使復(fù)制子的復(fù)制才能明顯下降.實(shí)驗(yàn)顯示，與不含適應(yīng)性變異的復(fù)制子比擬，NS4B區(qū)P1936

7、S變異復(fù)制才能增加12倍，NS5A區(qū)E2163G變異復(fù)制才能增加60倍，NS5B區(qū)R2884G變異的復(fù)制才能增加500倍，而NS4B加NS5B區(qū)結(jié)合變異，其復(fù)制才能僅增加20倍，NS5A加NS5B區(qū)結(jié)合變異那么未見克隆集落的形成.因此，這些變異可能具有性質(zhì)相反的作用inpatibility.NS3區(qū)變異總是與NS4B，NS5A，NS5B區(qū)至少1個(gè)變異相關(guān)，NS4B，NS5A或NS5B區(qū)單個(gè)變異賦予細(xì)胞培養(yǎng)的適應(yīng)性機(jī)制似乎不同于NS3區(qū)的變異.由上可見，適應(yīng)性變異可發(fā)生于所有HV非構(gòu)造蛋白區(qū)域，根據(jù)其對(duì)復(fù)制效率及協(xié)同性的影響，適應(yīng)性變異至少可分為兩組：NS3區(qū)變異：對(duì)復(fù)制效率影響小，但與高度適應(yīng)

8、性變異結(jié)合，可協(xié)同增加復(fù)制效率；NS4B，NS5A，NS5B區(qū)變異：對(duì)復(fù)制效率有明顯的增強(qiáng)作用，但互相之間結(jié)合可引起復(fù)制效率降低.此外，有人12構(gòu)建了一個(gè)含有1bNS35A骨架和2bNS5B的嵌合性1b:2b復(fù)制子，僅在NS5B區(qū)含有一個(gè)新的適應(yīng)性變異，即能在Huh7細(xì)胞中有效復(fù)制.1.3適應(yīng)性變異增加RNA復(fù)制效率的機(jī)制目前尚不清楚.根據(jù)一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NS3和NS5B區(qū)的替代常常位于分子的外表及遠(yuǎn)離各個(gè)酶活性中心，推測細(xì)胞適應(yīng)性變異主要是直接或間接地影響了復(fù)制子與宿主細(xì)胞因素的互相作用13.1.4細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異對(duì)體內(nèi)感染性的影響在細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異的研究中發(fā)現(xiàn)病毒基因的體內(nèi)感染性與體

9、外復(fù)制才能明顯不一致1,9,10,14.HVn1親代基因不含適應(yīng)性變異的別離株肝內(nèi)接種黑猩猩1k后，動(dòng)物即出現(xiàn)病毒血癥，隨后開展為持續(xù)性感染，平均病毒滴度達(dá)1108Eq/L，但其復(fù)制子的復(fù)制才能很弱，而在該基因的NS3區(qū)引入2個(gè)適應(yīng)性變異E1202G,T1280I及NS5A區(qū)引入1個(gè)適應(yīng)性變異S2197P的子代基因那么完全喪失了體內(nèi)感染性，但體外復(fù)制才能明顯增強(qiáng)，假如僅在NS5A區(qū)引入1個(gè)適應(yīng)性變異，動(dòng)物可被該子代基因感染，只是感染時(shí)間延后1k，而該基因復(fù)制子的復(fù)制才能較前者為弱.與上述觀察相一致的是，HVN別離株體內(nèi)感染性很弱，但其復(fù)制子即使缺乏細(xì)胞適應(yīng)性變異在Huh7細(xì)胞中的復(fù)制效率也較強(qiáng)

10、，這是由于在NS5A中心區(qū)有4個(gè)氨基酸的插入而賦予了該分子的適應(yīng)性表型及體內(nèi)耐受.另一個(gè)國際上知名的HV序列H77別離株具有很強(qiáng)的體內(nèi)感染性，但其復(fù)制子的構(gòu)建那么經(jīng)歷了相當(dāng)困難的過程，在H77序列的NS5A區(qū)引入了一個(gè)適應(yīng)性變異及NS3區(qū)引入了一個(gè)協(xié)同變異且采用了高度容受性的Huh7.5細(xì)胞系后，H77復(fù)制子才構(gòu)建成功.最近，Sarrazin等15對(duì)26名慢性HV1型感染患者的病毒基因NS3區(qū)和NS4BNS5B區(qū)含常見的31個(gè)復(fù)制子適應(yīng)性變異位點(diǎn)的序列進(jìn)展了研究，共發(fā)現(xiàn)5例患者分別在NS3區(qū)存在特異性變異P1112R，R1283G和S1496，該變異與基線HVRNA載量無關(guān)，但與干擾素治療過程

11、中RNA濃度緩慢下降有關(guān).2宿主細(xì)胞容受性宿主細(xì)胞容受性是指體外培養(yǎng)細(xì)胞支持HV復(fù)制的才能.采用瞬時(shí)復(fù)制檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)同一Huh7細(xì)胞系不同傳代細(xì)胞之間RNA復(fù)制程度可相差100倍以上，這種差異與引入復(fù)制子的適應(yīng)性變異無關(guān)且在親代HVn1RNA也可見這種現(xiàn)象3.然而，宿主細(xì)胞容受性的程度難以控制且其變化也不可預(yù)測.在細(xì)胞容受性有關(guān)因素的研究中，發(fā)現(xiàn)IRES依賴性HVRNA翻譯過程及RNA穩(wěn)定性方面的因素與此無關(guān).這樣，一個(gè)解釋可能是細(xì)胞容受性程度由RNA復(fù)制所需的某些宿主細(xì)胞因素的量及活性決定，支持該推測的證據(jù)是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)復(fù)制效率隨著轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞的復(fù)制子RNA量的增加而降低，說明Huh7細(xì)

12、胞中某些因素限制了RNA的復(fù)制.另一證據(jù)是有研究發(fā)現(xiàn)有效的HVRNA復(fù)制僅發(fā)生于Huh7細(xì)胞的一個(gè)亞群，推測非適應(yīng)性的HV復(fù)制子轉(zhuǎn)染后G418抗性集落形成的數(shù)量減少，不僅決定于引入的適應(yīng)性變異的頻率還決定于特定宿主細(xì)胞的容受性，G418挑選后獲得的細(xì)胞克隆會(huì)含有細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性復(fù)制子和/或是選擇出的具較高程度容受性的細(xì)胞亞群，實(shí)驗(yàn)也證明了這個(gè)假設(shè)16，用干擾素或能有效阻斷復(fù)制子RNA增殖的選擇性抑制劑處理攜帶穩(wěn)定復(fù)制HVRNA的Huh7細(xì)胞克隆，約2k后，大多數(shù)HVRNA分子被去除，產(chǎn)生了一群所謂的“ured細(xì)胞，用選擇性復(fù)制子再轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染過HVRNA的Huh7細(xì)胞nave比擬而言，

13、G418抗性集落的數(shù)量明顯增多，說明在G418處理過程中，具有較高容受性的Huh7細(xì)胞被選擇出來了.然而，由于容受性不是一種穩(wěn)定的表型，且用于比擬的“nave細(xì)胞也會(huì)發(fā)生變化，故“ured細(xì)胞與“nave細(xì)胞間容受性的差異是難以制備的，如實(shí)驗(yàn)顯示“ured細(xì)胞較“nave細(xì)胞第8代或第37代有更高的容受性，而較第128代或142代的容受性低，同時(shí)顯示“ured細(xì)胞容受性也不具有穩(wěn)定的特性.Zhu等17根據(jù)HV具有準(zhǔn)種的特性，想象到病毒群可能含有可以在不同細(xì)胞類型及不同種系中復(fù)制的變異株，且細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異可能擴(kuò)大HV的宿主細(xì)胞范圍，討論了HV在肝外組織及非靈長類細(xì)胞中復(fù)制的可能性，發(fā)現(xiàn)亞基因

14、組HV復(fù)制子可以在小鼠肝癌細(xì)胞系及人類上皮細(xì)胞HeLa中復(fù)制，從這種復(fù)制子細(xì)胞中別離的復(fù)制子含有一些新的變異，主要集中于NS4B與NS5A區(qū)，且發(fā)現(xiàn)幾個(gè)在Huh7復(fù)制子中從未出現(xiàn)的適應(yīng)性變異，說明可能存在細(xì)胞類型特異性的適應(yīng)性變異現(xiàn)象.該實(shí)驗(yàn)同時(shí)證明HVRNA復(fù)制并不絕對(duì)依賴于肝細(xì)胞或靈長類特異性的因素，換言之，影響HV復(fù)制的宿主因素并非是肝細(xì)胞及靈長類特異性的.綜上所述，有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性變異和宿主細(xì)胞容受性的深化研究，對(duì)最優(yōu)化的構(gòu)建不同基因型傳統(tǒng)的復(fù)制子或復(fù)制子瞬時(shí)系統(tǒng)及拓展容受性好的細(xì)胞系奠定根底，從而有助于進(jìn)一步建立能產(chǎn)生感染性病毒顆粒的系統(tǒng)，以便于病毒復(fù)制周期的研究，更重要的是宿主細(xì)

15、胞系的拓展可排除特定細(xì)胞系特異性因素的影響，使采用該模型系統(tǒng)所進(jìn)展的研究更具可靠性.【參考文獻(xiàn)】1BlightKJ,KlykhalvAA,Rie.EffiientinitiatinfHVRNArepliatininellultureJ.Siene,2000,290(5498):1972-1974.2LhannV,KrnerF,DbierzeskaA,etal.utatinsinhepatitisvirusRNAsnferringellultureadaptatinJ.JVirl,2001,75(3):1437-1449.3LhannV,HffannS,HerianU,etal.Viraland

16、ellulardeterinantsfhepatitisvirusRNArepliatininellultureJ.JVirl,2022,77(5):3007-3019.4rikJ,BrnD,GriffinS,etal.AlinkbeteentranslatinfthehepatitisvirusplyprtEinandplyerasefuntin;pssiblensequenesfrhyperphsphrylatinfNS5AJ.JGenVirl,2022,87(Pt1):93-102.5Blight,KJ,KeatingJA,artrigianJ,etal.Effiientrepliati

17、nfhepatitisvirusgentype1aRNAsinellultureJ.JVirl,2022,77(5):3181-3190.6LaA,FrikDN.HepatitisvirussubgenireplinrequiresanativeNS3RNAheliaseJ.JVirl,2022,80(1):404-411.7KishineH,SugiyaaK,Hijikata,etal.SubgenireplinderivedfraelllineinfetediththehepatitisvirusJ.BiheBiphysResun,2002,293(3):993-999.8KatN,Nak

18、auraT,DansakH,etal.GenetivariatinanddynaisfhepatitisvirusreplinsinlngterellultureJ.JGenVirl,2022,6(Pt3):645-656.9LhannV,KrnerF,KhJ,etal.RepliatinfsubgenihepatitisvirusRNAsinahepataelllineJ.Siene,1999,285(5424):110-113.10Ikeda,Yi,LiK,etal.SeletablesubgeniandgenelengthdiistrniRNAsderivedfraninfetiusle

19、ularlneftheHVNstrainfhepatitisvirusrepliateeffiientlyinulturedHuh7ellsJ.JVirl,2002,76(6):2997-3006.11TargettAdasP,LauhlanJ.Develpentandharaterizatinfatransientrepliatinassayfrthegentype2ahepatitisvirussubgenireplinJ.JGenVirl,2022,86:3075-3080.12GrahaDJ,Stahlhut,Flres,etal.Agentype2bNS5BplyeraseithnvelsubstitutinssupprtsrepliatinfahieriHV1b:2breplinntainingagentype1bNS35AbakgrundJ.AntiviralRes,2022,69:24-30.13BartenshlagerR,KaulA,Spara