新城疫抗體水平檢測(cè)

1、新城疫的血凝和血凝抑制試驗(yàn)高若開(kāi)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆昭脱种圃囼?yàn)的基本原理、操作方法和結(jié)果判定方法。分析血凝和血凝抑制試驗(yàn)的影響因素，用以確定最佳免疫時(shí)間、判定免疫效果和輔助疾病診斷。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容血凝試驗(yàn) （HA） 檢測(cè)新城疫抗原血凝抑制試驗(yàn) （HI） 檢測(cè)新城疫抗體三、實(shí)驗(yàn)原理血凝試驗(yàn)（ HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝 集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱(chēng)為血凝（ HA）, 也稱(chēng)直接血凝反應(yīng)。血凝抑制試驗(yàn)（ HI ）原理：當(dāng)在病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆粒 或其血凝素時(shí)， 則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蜓刂苯咏佑|。 這時(shí)紅細(xì)

2、胞的凝集現(xiàn)象就 被抑制，稱(chēng)為紅細(xì)胞凝集抑制（ HI ）反應(yīng)，也稱(chēng)血凝抑制反應(yīng)?？乖?抗體I am late ！四、實(shí)驗(yàn)材料離心機(jī)、恒溫箱、冰箱、振蕩器、96 孔血凝版（ 5 塊）、微量移液器（ 20-100 微升可調(diào)）、吸液尖（若干）、洗耳球、離心試管、普通試管、試管刷、燒杯、吸量管、一次性注射器、ND標(biāo)準(zhǔn)抗原、1%紅細(xì)胞懸液、抗凝劑、生理鹽水。五、實(shí)驗(yàn)步驟（一）抗凝劑的配制 將1克檸檬酸鈉用 25 毫升生理鹽水稀釋備用。 1毫升抗凝劑可用于采集 9毫升血液。（二）10%紅細(xì)胞懸液的配制1、用注射器吸取毫升抗凝劑無(wú)免疫健康青年公雞的紅細(xì)胞毫升。2、1500 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，吸棄上清液。3、用

3、 5-10 倍生理鹽水 1500 轉(zhuǎn)洗滌 3 次，前兩次 5 分鐘，后一次 10 分鐘。4、吸棄上清液，用吸量管吸取紅細(xì)胞，配制成10%紅細(xì)胞懸液。5、2-6 攝氏度儲(chǔ)存，備用。（三）血凝試驗(yàn)（ HA）在血凝板上第一排的 112 孔內(nèi)各加入 50ul 生理鹽水將系苗用生理鹽水 5 毫升稀釋?zhuān)诘?1 孔內(nèi)加入 50ul 病毒抗原，然后依次倍比稀釋至第 11 孔，最 后棄 50ul 。每孔加入 1雞紅細(xì)胞懸液 50ul輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37中靜置 30 分鐘結(jié)果判定 血凝效價(jià)測(cè)定12345678910111224816326412825651210242048紅細(xì)胞對(duì)照生理鹽水50505

4、0505050505050505050抗原5050505050505050505050棄 50紅細(xì)胞505050505050505050505050結(jié)果結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、：紅細(xì)胞呈細(xì)沙樣均勻鋪于孔底，即100凝集；2、：紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，當(dāng)邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75凝集；3、 ：紅細(xì)胞形成一個(gè)環(huán)狀，四周有凝集塊，即 50 凝集；4、 ：紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，即25凝集；5、 ：紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，邊緣光滑整齊，即無(wú)凝集。 血凝價(jià)的判定以 100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒的血凝價(jià)，即為一個(gè)凝集單位。上表看出，該新城疫病 毒液的血凝價(jià)為 1:32 ，則

5、l:32 為 1個(gè)血凝單位， 1:16 、l:8 分別為 2、4個(gè)血凝單位，或?qū)?32/4=8 ， 即 1:8 稀釋的病毒液為 4 個(gè)血凝單位。（四）4 個(gè)血凝單位抗原的配制 根據(jù)判定結(jié)果，吸取 1 毫升已稀釋的病原溶液再以 8 倍稀釋?zhuān)礊?4 個(gè)血凝單位的標(biāo)準(zhǔn)抗原。（五）血凝抑制試驗(yàn)1、在血凝板上 1 12 孔內(nèi)各加入 50ul 生理鹽水；2、在第 1孔內(nèi)加入被檢血清 50ul ，然后倍比稀釋至第 11 孔，最后棄 50ul ；3、第 112 孔內(nèi)加入 4單位抗原 50ul （第 12 孔為病毒對(duì)照）；4、每孔加入 1雞紅細(xì)胞懸液 50ul ；5、輕輕振蕩均勻，后放于室溫或37中靜置 30

6、 分鐘6、結(jié)果判定血凝抑制效價(jià)測(cè)定12345678910111224816326412825651210242048病毒對(duì)照生理鹽水505050505050505050505050血清5050505050505050505050棄 504 單位 抗原505050505050505050505050紅細(xì)胞505050505050505050505050結(jié)果結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)1、：紅細(xì)胞呈細(xì)沙樣均勻鋪于孔底，即100凝集；2、：紅細(xì)胞均勻鋪于孔底，當(dāng)邊緣不整齊而稍向孔底集中，即75凝集；3、 ：紅細(xì)胞形成一個(gè)環(huán)狀，四周有凝集塊，即 50 凝集；4、 ：紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊，

7、即25凝集；5、 ：紅細(xì)胞于孔底形成圓團(tuán)，邊緣光滑整齊，即無(wú)凝集。 血凝抑制價(jià)的判定將反應(yīng)板傾斜成 45 度角，沉于管底的細(xì)細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者為沉淀，表明紅細(xì)胞 未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明 紅細(xì)胞被病毒所凝集。 能將 4 單位病毒物質(zhì)凝集紅細(xì)胞的作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱(chēng)為該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)，用被檢血清的稀釋倍數(shù)或以2 為底的對(duì)數(shù) （10g2） 表示。如上例，該血清的紅細(xì)胞凝集抑制效價(jià)為 1：4或 HI 效價(jià)為 2（10g2） 。稀釋倍數(shù)24816326412825651210242048血清對(duì)照結(jié)果結(jié)果

8、分析： 在對(duì)照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下， 已完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制 滴度。（1）一般認(rèn)為雞的免疫臨界水平為 1:8（ 成年 ）或 1:16（ 雛雞 ） ，隨地區(qū)不同而稍有差異。雞血清 HI 抗體效價(jià)高于 1:16 時(shí)可適當(dāng)推遲新城疫免疫的時(shí)間， HI 抗體效價(jià)在 1:16 以下， 須進(jìn)行新城疫疫苗接疫種，在新城疫流行的地區(qū)或雞場(chǎng)，雞的免疫臨界水平應(yīng)稍提高。雞群的 HI 抗體水平(血凝抑制滴度)是以抽檢樣品的HI 抗體效價(jià) ( 2) 的幾何平均值表示的。如果某雞群的 10 份樣品中， HI 抗體效價(jià) ( 2)為 8的有 3份樣品，為 7的有 5份樣品，為 6的 有2 份樣品

9、，它們的平均值為：( 8 3 7 5 6 2)/ ( 3 5 2)平均水平在 4(10g2) 以上，說(shuō)明該雞群為免疫雞群。若在 檢樣中 HI 抗體效價(jià)的最高值與最低值相差太大時(shí)，則不能用上法計(jì)算平均水平，應(yīng)根據(jù)臨界水平以 下的樣品數(shù)在全部樣品中所占的百分比決定免疫與否。大型養(yǎng)雞場(chǎng)，每次進(jìn)行抽測(cè)時(shí)，抽樣率一般不低于一，小型雞群，抽樣率應(yīng)有所增加， 一般認(rèn)為理想的抽樣率應(yīng)為。(5) 雞群接種新城疫疫苗后，經(jīng)23周測(cè)血清中的 HI 抗體效價(jià)，若提高 2個(gè)滴度以上，表示雞的免疫應(yīng)答良好，疫苗接種成功；若HI 抗體效價(jià)無(wú)明顯提高，表示免疫失敗。( 6)若有 10%以上的雞群出現(xiàn)11(10g2) 以上的高血凝抑制滴度，說(shuō)明雞群已受新城疫強(qiáng)毒感染。若監(jiān)測(cè)雞群的免疫水平，用血凝抑制滴度在 4