氨基酸蛋白質(zhì)提取工藝特性

1、關(guān)于氨基酸蛋白質(zhì)提取工藝特性第一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、氨基酸的特性因氨基酸分子較小，且有羧基、氨基，同時(shí)具有堿性和酸性極性基團(tuán)較多，所以它的極性較大，能溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。因同時(shí)具有羧基和氨基，有酸堿兩性的性質(zhì)，能與酸和堿形成不同的鹽。當(dāng)溶液的pH發(fā)生變化時(shí)，溶液中的離子狀態(tài)也發(fā)生了變化。在電場中酸性溶液的氨基酸則向陰極電泳，而在堿性溶液中則向陽極電泳，當(dāng)溶液的pH值達(dá)一定時(shí)，氨基酸不向任何電極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值就是該氨基酸的等電點(diǎn)。不同的氨基酸有不同的等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)時(shí)氨基酸的溶解度最低，根據(jù)這種性質(zhì)可以用電泳法分離氨基酸。第二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于20

2、22年6月氨基酸在適當(dāng)?shù)臈l件下，能進(jìn)行有機(jī)胺或有機(jī)酸的幾乎全部反應(yīng)。與一般的酸和堿可生成穩(wěn)定的鹽，大部分均能溶于水，但與重金屬如銅、銀、汞等制成的絡(luò)合物不溶于水，也可利用這種性質(zhì)來分離氨基酸。第三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、氨基酸的浸出水浸出法：將中草藥以粉碎機(jī)粉碎，裝入逆流浸出罐組的每一個(gè)浸出罐中。用水做浸出溶劑，最好在有攪拌的條件下，加熱進(jìn)行逆流浸出。稀乙醇浸出法：將生藥粉末裝入逆流滲濾浸出罐組的每一個(gè)浸出罐中。以70%乙醇進(jìn)行滲濾浸出，先浸出的溶液濃度較大，后浸出的溶液濃度較低。最好采用逆流滲漉浸出法，把出液系數(shù)控制在5，可以得到較好的浸出效果。 第四張，PPT共三十二

3、頁，創(chuàng)作于2022年6月三、氨基酸的分離水浸出液或稀乙醇減壓濃縮后的水溶液往往含有幾種或十幾種氨基酸，因此所得的是總氨基酸，必須進(jìn)行分離純化。一般采用以下的純化方法：離子交換法:這是分離氨基酸的常用方法。可直接將水或稀乙醇提取物通過裝有離子交換樹脂的交換柱，帶正荷的氨基酸與樹脂上的-SO基吸附。由于氨基酸帶的正電荷隨溶液pH發(fā)生變化，同一氨基酸在不同pH的緩沖溶液中，以及不同氨基酸在同一pH的環(huán)境中，所帶的正電荷各不相同，與磺酸基吸附的強(qiáng)弱也相應(yīng)不同?？梢越柚@種差別，使氨基酸互相分離。第五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月成鹽分離法:利用某些酸性氨基酸與某些金屬化合物，如氫氧化鋇、氫

4、氧化鈣生成難溶性鹽，或某堿性氨基酸與一般酸生 成鹽，從而與其他未成鹽的氨基酸分離。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通過與過氯酸生成結(jié)晶性鹽而分出的。晶析法:利用不同氨基酸等電點(diǎn)不同，進(jìn)行晶析結(jié)晶分離。例如在含有亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的溶液，其pH值為1.52.0時(shí)，濃縮先晶析出亮氨酸，它的母液加鹽酸后再濃縮晶析出異亮氨酸，最后母液中回收纈氨酸。 第六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、氨基酸、肽的鑒別反應(yīng)茚三酮(Ninhydrin)反應(yīng)：所有的a-氨基酸及含有a-氨基酸的肽類和蛋白質(zhì)都能和該試劑反應(yīng)呈現(xiàn)蘭色或蘭紫色。必要時(shí)加熱，反應(yīng)可在濾紙上進(jìn)行。(2)吲哚醌(Isatin）試劑反應(yīng)：不

5、同的氨基酸與吲哚醌試劑反應(yīng)，能顯示不同的顏色。由于試劑的配制方法不同，對(duì)同一種氨基酸所顯示的顏色也往往有差異。吲哚醌不僅可用于氨基酸的顯色，而且從其顏色的區(qū)別，可以幫助辨認(rèn)氨基酸。顯色不穩(wěn)是其特點(diǎn)，氨對(duì)顯色無干擾。 第七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 蛋白質(zhì)提取工藝特性 一、不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其溶解性質(zhì)蛋白質(zhì)按其功能可分為活性蛋白和非活性蛋白二類；按結(jié)構(gòu)又可分為簡單蛋白和結(jié)合蛋白二類：再一種分類是根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差別而分為水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，還有一類硬蛋白，不溶于水、稀酸、稀堿和有機(jī)溶劑，遇強(qiáng)酸、強(qiáng)堿水解。 第八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋 白 質(zhì) 類

6、 別溶 解 性 質(zhì)簡單蛋白質(zhì)1.白蛋白2.球蛋白 a.真球蛋白 b.擬球蛋白3.醇溶蛋白4.谷蛋白5.精蛋白6.組蛋白1、溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。2、a.一般在等電點(diǎn)不溶于水，但加入少量的鹽、堿則可溶解。 b.溶于水，可為50%的飽和度硫酸銨析出。3、溶于7080%乙醇中，但不溶于水及無水乙醇。4、在等電點(diǎn)不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸，稀 堿溶液。5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。硬蛋白質(zhì)不溶于水、鹽、稀酸、稀堿結(jié)合蛋白質(zhì)(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白等)此類蛋白質(zhì)溶解度

7、性質(zhì)隨蛋白質(zhì)與非蛋白結(jié)合部分的不同而異， 除脂蛋白外，一般可溶于稀酸，稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂質(zhì)部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢(shì)，如脂質(zhì)部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢(shì)。表6-1 不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)及其溶解性質(zhì)第九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)及酶的一般提取方法1.水溶液提取 凡能溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿的蛋白質(zhì)或酶，一般都可用稀鹽溶液或緩沖溶液進(jìn)行提取。稀鹽溶液有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和增加蛋白質(zhì)溶解度。加入的提取液的量要適當(dāng)，加入量太少提取不完全，加的量太多，則不利于濃縮，一般用量為原材料36倍體積左右，可一次提取或分次提取。提取時(shí)常緩慢攪拌，以提高提取效率。以鹽溶液或緩沖

8、液提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)，常綜合考慮下列因素： 第十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)鹽濃度：提取蛋白質(zhì)的鹽的濃度，一般在0.020.2M的范圍內(nèi)。常用稀溶液和緩沖液有0.020.05M磷酸緩沖液，0.090.15M氯化鈉溶液。 (2)pH值：蛋白質(zhì)和酶所用的提取液pH值一般選擇在被提取的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)兩側(cè)的穩(wěn)定區(qū)內(nèi)。 (3)溫度：蛋白質(zhì)和酶一般都不耐熱，所以提取時(shí)通常要求低溫操作。第十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.有機(jī)溶劑提取一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，難溶于水、稀鹽、稀酸和稀堿，常用有機(jī)溶劑提取。如丙酮、異丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶于

9、水或部分溶于水，這些溶劑都同時(shí)有親脂性和親水性。其中正丁醇有較強(qiáng)的親脂性，也有一定親水性，在0時(shí)于水中有10.5的溶解度。它在水和脂分子間起著類似去污劑的作用，取代蛋白質(zhì)與脂質(zhì)重新與蛋白質(zhì)結(jié)合，使原來蛋白質(zhì)在水中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各種生物材料中解離脂蛋白的能力極強(qiáng)，是其他有機(jī)溶劑所不及的。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脫氫酶，對(duì)于堿性磷酸醋酶的提取效果也十分顯著。第十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于一定比例的有機(jī)溶劑。在這樣的情況下，采用稀的有機(jī)溶劑提取常常是為防止水解酶的破壞，并兼有除雜和提高純化效果的作用。第十三張，

10、PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、從細(xì)胞膜上提取水溶性蛋白質(zhì)的方法膜上的蛋白質(zhì)或酶一般有兩種存在狀態(tài)，一是在膜表面上，與膜成分聯(lián)系比較松；第二是膜的內(nèi)在成分之一，或與膜成分結(jié)合較緊。蛋白質(zhì)與膜成分的結(jié)合可通過脂質(zhì)形成復(fù)合物，也可以通過金屬離子與膜成分結(jié)合，或與膜其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。與膜成分結(jié)合較松的蛋白質(zhì)或酶，經(jīng)過充分破碎細(xì)胞，在一定pH范圍用稀鹽溶液即可提取分離。但一些與膜成分結(jié)合較牢或?qū)儆谀そM成的蛋白質(zhì)，提取則比較困難，須用超聲波、去污劑或其他比較強(qiáng)烈的化學(xué)處理，才能從膜上分離出來。主要方法有：第十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)濃鹽或尿素等溶液提取 如NaCl

11、O4、尿素、肌鹽酸等溶液均有人應(yīng)用于提取膜蛋白，當(dāng)以上溶液濃度達(dá)到2mol/L時(shí)，可提取27以上的膜蛋白，但使用這樣條件易引起蛋白質(zhì)和酶的變性。(2)堿溶液提取 堿性條件也可以解離與膜上成分結(jié)合的蛋白質(zhì)。在pH8-10范圍內(nèi)，某些膜蛋白隨著pH的提高而溶解度大大增加，至pHll時(shí)，有40%-50的膜蛋白被抽出，但堿提取法也容易引起蛋白質(zhì)和酶的失活，應(yīng)用上不廣。(3)加人金屬鰲合劑 蛋白質(zhì)通過金屬離子與膜成分結(jié)合時(shí)，加人金屬鰲合劑如EDTA可使蛋白質(zhì)釋放出來。用此法曾成功地提取了膜上ATP酶的偶聯(lián)因子I 。EDTA與超聲波聯(lián)合處理抽提膜上的磷酰轉(zhuǎn)移酶效果更好。第十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2

12、022年6月(4）有機(jī)溶劑抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇等溶劑抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上與脂質(zhì)結(jié)合的脂蛋白或膜內(nèi)脂蛋白組分最常用也較有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜內(nèi)脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在廣泛的pH (pH3-10)和溫度范圍（-240）內(nèi)使用。用有機(jī)溶劑結(jié)合其他方法已成功地提取了多種膜上蛋白質(zhì)和酶，如NPDH脫氫酶、唬珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、堿性磷酸酯酶、膽堿酯酶等。第十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(5)去垢劑處理 去垢劑處理是目前廣泛應(yīng)用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的去垢劑有弱離子去垢劑脫氧膽酸鹽、膽酸鹽，強(qiáng)離子型去垢劑十二烷

13、基磺酸鈉(SDS）和非離子型去垢劑Triton X-100和Tween, Lubrol和Brij等。去垢劑處理膜蛋白時(shí)的濃度通常為1左右，用此法提取的膜蛋白和酶有細(xì)胞色素BS、膽堿醋酶、細(xì)胞色素氧化酶、DPNH氧化酶、ADP/ATP載體蛋白等。第十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月用去垢劑分離膜蛋白時(shí)，選擇去垢劑首先考慮：去垢劑的溶解能力；去垢劑的溫和性。強(qiáng)離子型去垢劑（如SDS)一般具有很好的溶解能力，但溫和情況不理想，容易引起蛋白質(zhì)變性。弱離子型或非離子型去垢劑對(duì)蛋白質(zhì)變性影響較小，而溶解能力差。去垢劑的溶解能力與溶液的離子強(qiáng)度大小有關(guān)。一般來說，離子強(qiáng)度增加，去垢劑的溶解能力也

14、隨之增大。所以使用去垢劑溶解膜蛋白時(shí)，須考慮各種條件。根據(jù)Klingenberg等的經(jīng)驗(yàn)，分離線粒體膜DP/ATP載體蛋白，選用Triton X100比用Lubrol, Brij和Aminoxide等去垢劑效果更好，所得ADP/ATP載體蛋白具有較高的天然活性。但主要缺點(diǎn)是riton X100在280nm處有強(qiáng)的紫外吸收，干擾用紫外法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。第十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白質(zhì)一脂質(zhì)復(fù)合物 從蛇毒中提取的磷酸醋酶A主要作用于磷脂，最適pH為6-8。從胰臟中提取的醋酶作用于單、二、三甘油醋，酶作用最適pH為7-8o醋酶和磷酸醋酶均需要Ca

15、2激活。用酶法處理提取的膜蛋白及酶有細(xì)胞色素C、 a-磷酸甘油脫氫酶、TPNH-細(xì)胞色素C還原酶等。第十九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、蛋白質(zhì)的純化方法1.根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同來純化蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)、多肽及氨基酸都是兩性電解質(zhì)，在一定pH環(huán)境中，某一種蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，或解離成兩性離子，其凈電荷為零，此時(shí)環(huán)境的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)性質(zhì)比較穩(wěn)定，其物理性質(zhì)如導(dǎo)電性、溶解度、粘度、滲透壓等皆最小，因此可以利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小的特性來制備或沉淀蛋白質(zhì)。 等電點(diǎn)沉淀 等電點(diǎn)除雜第二十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.根據(jù)蛋白質(zhì)

16、分子形狀和大小的不同來純化蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的一個(gè)主要特點(diǎn)是：分子大，而且不同種類的蛋白質(zhì)分子大小也不相等。由此可以用凝膠過濾法、超濾法、離心法及透析法等將蛋白質(zhì)與其它小分子物質(zhì)分離，也可將大小不同的蛋白質(zhì)分離。 凝膠過濾層析第二十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的不同來純化蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的溶解度受溶液的pH、離子強(qiáng)度、溶劑的電解質(zhì)性質(zhì)及溫度等多種因素的影響。在同一特定條件下，不同的蛋白質(zhì)有不同的溶解度，達(dá)到分離的目的。鹽溶與鹽析，結(jié)晶，低溫有機(jī)溶劑沉淀法。如:鹽析和有機(jī)溶劑分級(jí)分離法。4.根據(jù)蛋白質(zhì)電離性質(zhì)的不同來純化蛋白質(zhì) 離子交換劑作為一種固定相，本身具有正離

17、子或負(fù)離子基團(tuán)，它對(duì)溶液中不同的帶電物質(zhì)呈現(xiàn)不同的親和力，從而使這些物質(zhì)分離提純。 蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸具有能夠離子化的基團(tuán)。 對(duì)蛋白質(zhì)的離子交換層析，一般多用離子交換纖維和以葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠為骨架的離子交換劑。主要是取得其有較大的蛋白質(zhì)吸附容量、較高的流速和分辨力。第二十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5.根據(jù)蛋白質(zhì)功能專一性的不同來純化蛋白質(zhì)。 主要手段是親和層析法，即利用蛋白質(zhì)分子能與其相應(yīng)的配體進(jìn)行特異性的、非共價(jià)鍵的可逆性結(jié)合而達(dá)到純化的目的。 固相化金屬親和層析IMAC是新發(fā)展的一種親和層析技術(shù)。蛋白質(zhì)分子中的咪唑基和巰基可與一些金屬元素（如Cu2

18、+,Zn2+)形成配位結(jié)合，使蛋白質(zhì)得到分離純化。第二十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6.根據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)與相應(yīng)的載體基團(tuán)結(jié)合來純化蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)上有疏水區(qū)，它們主要由酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等非極性的側(cè)鏈密集在一起，并暴露于分子表面。這些疏水區(qū)能夠與吸附劑上的疏水性基團(tuán)結(jié)合，在通過降低介質(zhì)的離子強(qiáng)度和極性等方法將蛋白質(zhì)洗脫下來。如疏水相互作用層析7.根據(jù)蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配的不同來純化蛋白質(zhì) 逆流分配色譜第二十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月8.根據(jù)蛋白質(zhì)受物理、化學(xué)等作用因素的影響來純化蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)易受pH、溫度、酸堿、金屬離子、蛋白質(zhì)沉

19、淀劑，絡(luò)合劑等的影響，用于各種蛋白質(zhì)都存在差異，可利用這種差異來分離純化蛋白質(zhì)。 如：電泳法、結(jié)晶純化第二十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9.根據(jù)蛋白質(zhì)的選擇性吸附性質(zhì)來純化蛋白質(zhì) 在蛋白質(zhì)分離中，最廣泛使用的吸附劑有結(jié)晶磷酸鈣，磷酸鈣凝膠，硅膠，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化鋁以及活性炭等。如：吸附層析10.根據(jù)酶對(duì)蛋白質(zhì)的作用來純化蛋白質(zhì) SOD酶抗蛋白水解酶。 親和層析第二十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月總之，蛋白質(zhì)和酶從細(xì)胞內(nèi)提取出來后，仍處于十分混雜的體系中，必須進(jìn)一步純化。但經(jīng)過提取除去了大量與制備性質(zhì)差別較大的雜質(zhì)，只剩余與制備物理性質(zhì)大致相近或類

20、似的物質(zhì)。因此，經(jīng)過有選擇性的提取這一步驟，對(duì)以后純化工作創(chuàng)造十分有利條件。蛋白質(zhì)和酶溶劑提取后進(jìn)一步分離純化常用方法有如下幾種： 第二十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)鹽析法；(2)等電點(diǎn)沉淀法；(3)有機(jī)溶劑分級(jí)分離法；(4)層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析）；(5)電泳法（等電聚焦電泳、雙向凝膠電泳）(6)結(jié)晶純化等。第二十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、蛋白質(zhì)的鑒別方法雙縮脲(Biuret）反應(yīng)：本試劑為1 CuS04和40%NaOH溶液等量混合。主要是Cu +2與蛋白質(zhì)或肽分子中肽鍵-CO-NH-絡(luò)合呈色。蛋白質(zhì)水提液和上述試劑反應(yīng)，顯紅紫色。這是檢驗(yàn)雙縮脲以及有兩個(gè)肽鍵以上的化合物的一個(gè)方法。雙縮脲不溶