大腸埃希菌多重耐藥與Ⅰ類(lèi)整合子的關(guān)系

1、大腸埃希菌多重耐藥與類(lèi)整合子的關(guān)系【摘要】目的監(jiān)測(cè)大腸埃希菌臨床別離株的耐藥性，理解大腸埃希菌中類(lèi)整合子的流行情況和分子特性。方法臨床別離114株大腸埃希菌經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)鑒定并檢測(cè)耐藥性，應(yīng)用PR法擴(kuò)增質(zhì)粒DNA上類(lèi)整合子，對(duì)PR產(chǎn)物進(jìn)展酶切分析和DNA測(cè)序。將序列結(jié)果在GenBank中搜索，確定類(lèi)整合子可變區(qū)基因盒的種類(lèi)和排列。結(jié)果細(xì)菌耐藥率50%，且大多為多重耐藥菌(耐受3種以上抗生素)。在58株細(xì)菌的質(zhì)粒DNA上檢測(cè)到類(lèi)整合子序列，大小約6003500bp，各含13個(gè)類(lèi)整合子。整合子中最常見(jiàn)的基因盒為dfrl7(甲氧芐啶耐藥基因)與aadA5(鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因)，最主要的基

2、因盒排列為dfrl7-aadA5。絕大多數(shù)攜帶甲氧芐啶耐藥基因盒的菌株對(duì)復(fù)方新諾明耐受，大多數(shù)攜帶鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因盒的菌株對(duì)鏈霉素不敏感。結(jié)論目前臨床別離的大腸埃希菌耐藥性強(qiáng)，并廣泛存在類(lèi)整合子。菌株攜帶基因盒和耐藥表型之間有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，基因盒介導(dǎo)了細(xì)菌耐藥性。細(xì)菌的多重耐藥率與類(lèi)整合子的陽(yáng)性率相關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】大腸桿菌157;藥物耐受性;整合子類(lèi);基因,細(xì)菌;抗菌藥大腸埃希菌是引起人類(lèi)感染最常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌1，其耐藥形勢(shì)非常嚴(yán)峻。細(xì)菌耐藥性通常由獲得耐藥基因引起，耐藥基因的程度傳播使耐藥菌株廣泛流行2。整合子是耐藥基因程度轉(zhuǎn)移的主要因子，是含有位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)和基因盒的遺傳構(gòu)造，

3、也是一個(gè)基因盒整合和切除系統(tǒng)，包括對(duì)基因盒的捕獲、切除和表達(dá)3。整合子根據(jù)整合酶的不同而分類(lèi)，其中類(lèi)整合子最常見(jiàn)，本研究分析大腸埃希菌中類(lèi)整合子的流行情況和分子特性。1材料與方法1.1菌株于2022年10月-12月自福建省立醫(yī)院各科室臨床標(biāo)本中別離大腸埃希菌114株，細(xì)菌經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)(Vitek2，美國(guó)Bierieux)檢測(cè)并進(jìn)展22種抗生素敏感性測(cè)定。對(duì)四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素、萘啶酸的耐藥性用紙片法測(cè)定。1.2方法1.2.1PR試劑及反響條件用堿裂解法制備PR模板質(zhì)粒DNA，類(lèi)整合子的引物序列：上游：5-GGATAAGAGAAG-3下游：5-AAGAGATTGATGA-3PR反響體系

4、：模板1L，上下游引物(l0l/L)各1L，dNTP(200l/L)2L，10buffer，gl2(25l/L)2.5L，TaqDNA聚合酶(5U/L)0.125L，超純水17.375。反響條件：預(yù)變性946in變性9430s退火601in722in，35個(gè)循環(huán);延伸7210in。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)展瓊脂糖電泳檢測(cè)。1.2.2限制性內(nèi)切酶反響HinfI(10U/L,TakaRa)，酶切反響體系：PR產(chǎn)物6L，10酶切緩沖液1L，Hinfl(10U/L)0.5L，超純水2.5L。37反響14h，參加1L10酶切緩沖液終止反響，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)展瓊脂糖電泳檢測(cè)。1.2.3PR產(chǎn)物測(cè)序PR產(chǎn)物的純化及測(cè)序由大

5、連寶生物工程完成。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用2檢驗(yàn)，細(xì)菌多重耐藥率和整合子陽(yáng)性率進(jìn)展顯著性檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1大腸埃希菌的鑒定和藥敏114株大腸埃希菌經(jīng)Bierieux全自動(dòng)細(xì)菌分析儀鑒定，對(duì)26種抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果分析，細(xì)菌對(duì)其中12種抗生素的耐藥率50%，耐藥率高的抗生素包括氨芐青霉素(100%)、復(fù)方新諾明(80%)、氨芐西林/舒巴坦(80%)、左旋氧氟沙星(64.8%)慶大霉素(60%)等;中介率最高的為妥布霉素(40%);敏感率最高的是亞胺硫霉素(亞胺培南，100%)。2.2類(lèi)整合子的檢測(cè)結(jié)果對(duì)114

6、株大腸埃希菌進(jìn)展類(lèi)整合子的擴(kuò)增，陽(yáng)性58株，PR產(chǎn)物的大小分別為600，1000，1600，2000，2500，3500bp各株細(xì)菌含13個(gè)類(lèi)整合子。根據(jù)各株細(xì)菌質(zhì)粒DNA上檢測(cè)到類(lèi)整合子的大小和數(shù)目，細(xì)菌質(zhì)粒DNA上的整合子可分為10種整合子譜(表1，圖1)。表1類(lèi)整合子譜1-9:不同類(lèi)型的類(lèi)整合子;10:200bpDNAladder2.3類(lèi)整合子中基因盒分析選擇600，1000，1600，2000bp的類(lèi)整合子送公司進(jìn)展純化及測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中用Blastn進(jìn)展核酸序列搜索，各整合子中所含基因盒種類(lèi)和排列見(jiàn)表2。600，1000，1600bp整合子序列與GenBank中序列

7、號(hào)為AY748452.1、AB154408.1、DQ663488的核酸序列一樣。表2各整合子所含的基因盒種類(lèi)和排列攜帶基因盒dfr17的47株細(xì)菌中，40株對(duì)復(fù)方新諾明耐藥，攜帶基因盒aadA2或aadA5的47株細(xì)菌中，39株對(duì)鏈霉素耐藥，攜帶基因盒a(6)的2株細(xì)菌對(duì)慶大霉素、妥布霉素均耐藥，說(shuō)明細(xì)菌的耐藥表型與其攜帶的基因盒有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。有4株攜帶dfr17-aadA5基因盒的菌株對(duì)鏈霉素敏感，這種現(xiàn)象可能是由于耐藥基因的低程度表達(dá)或沉默引起的4。2.4酶切結(jié)果對(duì)于電泳檢測(cè)為大小一樣的類(lèi)整合子，選用內(nèi)切酶HinfI對(duì)類(lèi)整合子進(jìn)展酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)展電泳檢測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個(gè)600

8、bp，3個(gè)1000bp，44個(gè)1600bp，2個(gè)2000bp的整合子分別是一樣的DNA序列(圖2)。2.5類(lèi)整合子與多重耐藥的關(guān)系類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株比陰性的菌株更易表觀出對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)及第三代頭孢菌素藥物的耐藥性，也更易介導(dǎo)多重耐藥性，類(lèi)整合子陽(yáng)性的菌株與大腸埃希氏菌多重耐藥(耐受3種以上抗生素)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(2檢驗(yàn)，2=9.48)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05，表3)，說(shuō)明細(xì)菌多重耐藥與整合子有關(guān)。表3類(lèi)整合子與多重耐藥的關(guān)系3討論本組中114株大腸埃希菌中有58株(50.9%)攜帶I類(lèi)整合子，整合子中最常見(jiàn)的基因盒為鏈霉素、壯觀霉素耐藥基因盒(aadA)，以及甲氧芐啶耐藥基因盒

9、(dfr17)。原因是：鏈霉素、壯觀霉素在食源性動(dòng)物飼養(yǎng)中還廣泛使用，所以人類(lèi)可以通過(guò)食物鏈或接觸動(dòng)物獲得相應(yīng)基因盒的整合子5。甲氧芐啶在泌尿道感染的治療中，作為一線藥物使用，造成甲氧芐啶的選擇性壓力很大6。aadA和dfr兩個(gè)基因家族與整合子關(guān)系最親密，是整合子介導(dǎo)的最常見(jiàn)的抗藥基因型7。實(shí)驗(yàn)觀察到細(xì)菌攜帶基因盒與其耐藥表型有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這充分說(shuō)明了基因盒中的耐藥基因介導(dǎo)了細(xì)菌相應(yīng)的耐藥性，整合子在介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性方面發(fā)揮著重要作用，因此監(jiān)測(cè)臨床別離株整合子的耐藥基因盒對(duì)指導(dǎo)臨床用藥有一定作用。類(lèi)整合子陽(yáng)性菌的耐藥率高于陰性菌株,整合子陽(yáng)性的菌株對(duì)抗生素的多重耐藥率也顯著高于整合子陰性的菌

10、株，整合子陽(yáng)性的菌株更易表現(xiàn)出對(duì)青霉素類(lèi)、磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)的多重耐藥。說(shuō)明多重耐藥菌在院內(nèi)的爆發(fā)流行與其攜帶的整合子有關(guān)。整合子具有通過(guò)位點(diǎn)特異重組機(jī)制整合多個(gè)耐藥基因盒的才能8。醫(yī)院環(huán)境下的臨床菌株在更大的抗生素選擇性壓力下，耐藥基因盒更容易被整合子捕獲和積聚。目前，幾乎每一類(lèi)抗生素的耐藥基因盒都被發(fā)現(xiàn)，但世界各地均發(fā)現(xiàn)耐藥基因盒主要與傳統(tǒng)抗生素相關(guān)，如鏈霉素、甲氧芐啶、早期的氨基糖苷類(lèi)藥物。然而，新抗生素的耐藥基因盒己經(jīng)出現(xiàn)，如blaIP(編碼對(duì)亞胺培南、廣譜-內(nèi)酸胺類(lèi)抗生素的耐藥性)、aaA7(編碼對(duì)新氨基糖昔類(lèi)藥物如阿米卡星、奈替米星的耐藥性)，這些基因盒還沒(méi)有獲得足夠的選擇壓力或時(shí)間

11、廣泛傳播，而整合子具有強(qiáng)大的捕獲和積聚基因盒的才能，可能不久將使這些新抗生素的耐藥基因盒流行5。因此，整合子將繼續(xù)影響抗生素的有效性?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1李華,馬筱玲.臨床別離大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)J.安徽醫(yī)學(xué),2022(1):72-73.2楊仁國(guó),呂曉菊.整合子系統(tǒng)與細(xì)菌多重耐藥研究進(jìn)展J.中國(guó)抗生素雜志，2022，33(4):198-202.3陳紅英,胡功政,李新生,等.整合子與細(xì)菌多重耐藥性J.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，27(4)：29-32.4SeverinP,agalhaesVD.Therlefintegrnsinthedisseinatinfanti-bitiresistaneanglini

12、alislatesfPseudnasaeruginsafranintensiveareunitinBrazilJ.Resirbil,2002,153(4):221-226.5RiberaA,VilaJ,Fernandez-uenaF,etal.Type1integrnsinepideilgi-allyunrelatedAinetbaterbauanniiislateslletedatSpanishhspitalsJ.AntiirbAgentshether,2022,48(1):364-365.6aguireAJ,BrnDF,GrayJJ,etal.Rapidsreeningtehniquefrlass1integrnsinEnterbateriaeaeandnnferentinggra-negativebateriaanditsuseinleularepideilgyJ.AntiirbAgentshether,2001,45(4):1022-1029.7石磊,陳洵,肖增磺.多重耐藥臨床菌株中整合子構(gòu)造的監(jiān)測(cè)與分析J.中國(guó)抗生素雜志,2022,32(1):43-48.8Daly,Bukley