藥典微生物相關(guān)培訓(xùn) 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)解析

1、中國藥典2015年版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)解析楊曉莉陜西省食品藥品檢驗(yàn)所2015年08月16日目標(biāo)藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施。歐、美、日等主要藥典均收載了協(xié)調(diào)一致的微生物限度檢查法及限度標(biāo)準(zhǔn)，由于歷史原因，我國目前的微生物限度檢查體系與國際相比存在差距，這一差距對(duì)于目前我國企業(yè)產(chǎn)品出口造成很大的障礙，也對(duì)我國的微生物質(zhì)量控制造成很大困惑。中國藥典2015年版修訂的總體目標(biāo)：“中藥引領(lǐng)國際發(fā)展，化學(xué)藥品與國際接軌”。主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)基適用性檢查3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品檢查456結(jié)果判斷新理念主要內(nèi)容1格式和通用要求變化格式變化結(jié)合

2、國情 國際同步USP35中國藥典2010版中國藥典2015版非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）MicrobiologicalExamination ofNonsterile Products:Microbial EnumerationTests附錄 C/附錄J：微生物限度檢查法XI非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）附錄 C/附錄 XIJ：微生物限度檢查法MicrobiologicalExamination ofNonsterile Products:Tests for SpecifiedMicroorganismsMicrobiologicalAttri

3、butes of NonsterilePharmaceutical Product附錄 C/附錄 XIJ：微生物限度檢查法非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）格式變化中國藥典2010年版微生物計(jì)數(shù)法編排方式中國藥典2015年版微生物計(jì)數(shù)法編排方式內(nèi)容變化中和劑、滅活劑通用要求變化適用范圍2010版2015版系檢查非規(guī)定滅菌制劑 微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的及其原料、 嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。輔料受微生物污染程度的方法 明確規(guī)定本法不適用于活菌制劑的檢查。 增加了檢測產(chǎn)品的范圍。通用要求變化適用范圍原核細(xì)胞：細(xì)菌、放線菌、立克次氏體、支原體、衣原體、藍(lán)細(xì)菌和古細(xì)菌真核細(xì)胞：酵母菌、霉

4、菌、粘菌、原生動(dòng)物和藻類微生物無細(xì)胞結(jié)構(gòu)：病毒、噬菌體、類病毒、擬病毒和朊病毒備注：即除細(xì)菌、真菌外其它微生物也需要關(guān)注其有害性。通用要求變化檢測環(huán)境變化微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境要求微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防治污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測。（第三公示稿）9203：藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則“微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級(jí)背景下的B級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行”。9205：藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)藥品微生物檢驗(yàn)用的潔凈室等受控環(huán)境微生物污染情況的檢測和控制。通用要求

5、變化試劑和試藥試劑和試藥中和劑、滅活劑和表面活性劑均應(yīng)對(duì)微生物無毒性，其相互間具有相容性，有利于樣品中微生物均勻分散。稀釋液1、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；2、pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液；如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。3、0.9%無菌氯化鈉溶液。通用要求變化培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基 按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理，由中檢院負(fù)責(zé)研制分發(fā)。培養(yǎng)基適用性試驗(yàn) 2皿（0.52.0），2管（生長良好）。通用要求變化培養(yǎng)基計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基a.需氧菌總數(shù)：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）b.霉菌和酵母菌總數(shù)：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）,玫

6、瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或含抗生素的SDA。通用要求變化-計(jì)數(shù)的方法2010版2015版1. 平皿法：包括傾注法和涂布法。該項(xiàng)下明確可使用直徑較大平皿，且培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。2. 薄膜過濾法。3.1.平皿傾注法2.薄膜過濾法MPN)。 MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。注：方法選擇原則：根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇。平皿法之傾注法與涂布法通用要求變化-計(jì)數(shù)的方法平皿法之傾注法與涂布法比較傾注法涂布法將培養(yǎng)基冷卻后，加一定量的菌液，用涂布器均勻涂布后，待菌液被滲透吸收，倒置培養(yǎng)。先加一定量的菌液，然后加入培養(yǎng)基，混勻冷

7、卻后倒置培養(yǎng)。操作 培養(yǎng)基表面適宜好氧菌，內(nèi)部適宜 培養(yǎng)基適合好氧菌培養(yǎng)。兼性厭氧菌培養(yǎng)。 操作較繁瑣，增加污染幾率。 一次接種量不少于0.1ml樣品。特 操做方便快捷。點(diǎn) 接種量為1ml或更多樣品。 不可使用預(yù)制培養(yǎng)基。 計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，涂布器會(huì)沾少許微生物。 可以使用預(yù)制培養(yǎng)基。通用要求變化-計(jì)數(shù)的方法薄膜過濾法微生物檢測用濾膜孔徑不大于0.45m，直徑50mm，總沖洗量不超過1000ml。通用要求變化-計(jì)數(shù)的方法MPN法最可能數(shù)法的精確性不及平皿法和薄膜過濾法，不適宜霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，該法適用于某些含菌量較低的供試品需氧菌總數(shù)測定。因此，該法僅在沒有其他方法可供選擇的情況下，作為需氧菌總數(shù)計(jì)

8、數(shù)法 。增加方法例如食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.3-2010中大腸菌群的MPN計(jì)數(shù)法，其優(yōu)點(diǎn)在于少量菌在經(jīng)過增菌后進(jìn)行直接觀察結(jié)果，通過查表得到計(jì)數(shù)結(jié)果。通用要求變化菌種及菌液制備 表1試驗(yàn)菌液的制備和使用項(xiàng)下包括：試驗(yàn)菌株、試驗(yàn)菌液的制備方法、計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查以及計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。通用要求-菌種及菌液制備2010版2015版試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。目前均使用CMCC。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2

9、8，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。通用要求菌種及菌液制備9203：藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則菌種藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株如果經(jīng)過確認(rèn)試驗(yàn)證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時(shí)，應(yīng)及時(shí)滅菌銷毀。通用要求菌種及菌液制備菌種編號(hào) CMCC 中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心CMCC（B ）或 CMCC（F ）B 代表細(xì)菌、F 代表真菌 ATCC 美國

10、標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心著名的微生物保藏中心，創(chuàng)立于1899年，設(shè)在美國馬里蘭州羅克維爾市。收藏有細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物病毒、噬菌體、藻類和原生生物等共計(jì)16000株以上的微生物種株。通用要求菌種及菌液制備.菌種的保藏原則：低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)環(huán)境抑制微生物的代謝和生長繁殖。.各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身操作習(xí)慣總結(jié)出一套切實(shí)可行、快速穩(wěn)定的菌液制備SOP。通用要求菌種及菌液制備菌株中國藥典協(xié)調(diào)案枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisCMCC(B)63501 ATCC6633及其他CMCC(B)26003 ATCC6538及其他金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus銅綠假單胞菌Pseu

11、domonas aeruginosaCMCC(B)10104ATCC9027及其他大腸埃希菌Escherichia coliCMCC(B)44102 ATCC8739及其他CMCC(F)98001 ATCC10231及其他CMCC(F)98003 ATCC16404及其他白色念珠菌Candida albicans黑曲霉Aspergillus niger通用要求菌種及菌液制備2010版2015版銅綠假單胞菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、 黑曲霉 桿菌、白色念珠菌、黑曲霉大腸埃希菌是發(fā)酵的革蘭陰性短小直桿菌，兼性厭氧，在有氧條件下生長良好，常有光滑型

12、、粗糙型和粘液型。銅綠假單胞菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，屬專性需氧菌，菌落形態(tài)較為一致，并產(chǎn)生水溶性色素。主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查2010版2015版1.胰酪大豆胨瓊脂和胰酪大豆胨肉湯用于需氧菌總數(shù)測定。2.沙氏葡萄糖瓊脂用于霉菌和酵母菌總數(shù)測定。1. 營養(yǎng)瓊脂用于細(xì)菌計(jì)數(shù)。2. 玫瑰紅鈉瓊脂用于霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。3.含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂）。3. 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂用于酵母菌計(jì)數(shù)。4. 菌液制備用稀釋液：0.9氯化鈉溶液4.菌液制備用培養(yǎng)基：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液。培養(yǎng)基適用性檢查營

13、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基檢出菌落總數(shù)的比較細(xì)菌數(shù)（cfu/g）霉菌及酵母菌數(shù)（cfu/g）樣 編品 號(hào)普通營養(yǎng) 胰酪大豆胨 玫瑰紅鈉瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂瓊脂瓊脂1560011600101010101010XXXX丸23451011010901010101045001101010備注：培養(yǎng)基應(yīng)具備廣譜性，有助于產(chǎn)品中所有存活微生物生長。培養(yǎng)基適用性檢查2010版2015版1. 胰酪大豆胨瓊脂：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色1. 營養(yǎng)瓊脂：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿 念珠菌、黑曲霉。菌。2. 胰酪大豆胨肉湯：金黃色葡萄球菌、2. 玫瑰紅鈉瓊脂：白色念珠菌、 銅

14、綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌。黑曲霉。3. 沙氏葡萄糖瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂：白色念珠菌、黑曲霉。培養(yǎng)基適用性檢查2015版需氧菌總數(shù)：2010版細(xì)菌數(shù)：營養(yǎng)瓊脂胰酪大豆胨瓊脂3035 ，48小時(shí)3035 細(xì)菌不大于3days真菌不大于5days霉菌及酵母菌數(shù)：玫瑰紅鈉瓊脂霉菌和酵母菌總數(shù)：沙氏葡萄糖瓊脂/玫瑰紅鈉瓊脂2025 不大于5 days2328 ，72小時(shí)培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)條件嗜熱型微生物最適生長溫度為4558；嗜溫型為2543；嗜冷型為1018。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37，白色念珠菌和黑曲霉最適生長溫度為28，均為嗜溫型微生物。培養(yǎng)基適用性檢查2010版

15、2015版微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。范圍 固體培養(yǎng)基加菌量 50100cfu不大于100cfu營養(yǎng)瓊脂：3035玫瑰紅鈉瓊脂：2328胰酪大豆胨瓊脂/胰酪大豆胨肉湯：3035沙氏葡萄糖瓊脂/玫瑰紅鈉瓊脂：2025培養(yǎng)溫度培養(yǎng) 細(xì)菌：48h時(shí)間 真菌：72h細(xì)菌不超過3天；真菌、黑曲霉不超過5天。判定標(biāo)準(zhǔn)固體培養(yǎng)基：0.52（50200）液體培養(yǎng)基：生長良好。70培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查示例名稱胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基取已滅菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1520ml，注入直徑90mm的無菌平皿中，于3035培養(yǎng)3天。陰性對(duì)照金黃色葡萄球菌、銅

16、綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗(yàn)用菌株接種方法涂布法：分別接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于胰酪大豆胨瓊脂平皿上；傾注法：分別接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于直徑90mm的無菌平皿中，傾注約1520ml培養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌于3035培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉于3035培養(yǎng)不超判斷標(biāo)準(zhǔn) 過5天。與對(duì)照培養(yǎng)基比較，比值在0.52范圍內(nèi)，且菌落大小、形態(tài)一致。陰性對(duì)照：3035培養(yǎng)35天無菌落生長。培養(yǎng)基適用性檢查示例名稱胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基取已滅菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，于3035培養(yǎng)3天，觀察其是否變渾濁。陰性對(duì)照

17、試驗(yàn)用菌種 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌試驗(yàn)用菌接種方法判定標(biāo)準(zhǔn)懸液于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu，搖勻。適用性檢查：3035培養(yǎng)不超過3天，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種后與對(duì)照培養(yǎng)基比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。（建議：培養(yǎng)基呈混濁的液體，或劃線于相應(yīng)的分離平板上，培養(yǎng)后呈現(xiàn)典型菌落）陰性對(duì)照：3035培養(yǎng)不少于3天，培養(yǎng)基呈澄清的液體。培養(yǎng)基適用性檢查示例名稱沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基取已滅菌的培養(yǎng)基1520ml注入直徑90mm的無菌平皿中，于2025培養(yǎng)5天。陰性對(duì)照試驗(yàn)用菌種 白色念珠菌、

18、黑曲霉涂布法：分別接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于該培養(yǎng)基平皿上。接種方法 傾注法：分別接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌懸液于直徑90mm的無菌平皿中,傾注1520ml該培養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查：白色念珠菌、黑曲霉于2025培養(yǎng)不超過5天。與對(duì)判斷標(biāo)準(zhǔn) 照培養(yǎng)基比較，比值在0.52范圍內(nèi)，且菌落大小、形態(tài)一致。陰性對(duì)照：2025培養(yǎng)5天,無菌落生長。培養(yǎng)基適用性檢查沙氏葡萄糖瓊脂+抗生素名稱（當(dāng)細(xì)菌超標(biāo)引起需氧菌總數(shù)超標(biāo)時(shí)用）陰性對(duì)照及培養(yǎng)基適用性檢查同沙氏葡萄糖瓊脂，增加抑菌性檢查試驗(yàn)。抑菌性檢查：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抑菌性試驗(yàn)用菌種 孢桿菌促生長能力：白色念珠菌、黑曲

19、霉1、慶大霉素：廣譜。對(duì)G-、G+菌有較好的抗菌作用。常用抗生素 2、氯霉素：廣譜。對(duì)G-菌作用強(qiáng)；對(duì)G+作用不及青霉素與四環(huán)素。抑菌性：接種不少于100cfu試驗(yàn)用菌。促生長能力：接種不大于100cfu試驗(yàn)用菌。接種方法白色念珠菌、黑曲霉菌于2025培養(yǎng)不大于5天。與對(duì)照培養(yǎng)基比較，比值在0.52范圍內(nèi)。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌應(yīng)不得生長。判斷標(biāo)準(zhǔn). 抗生素抗菌譜：. 1、青霉素：窄譜。對(duì)其敏感菌株有G+球菌：溶血性鏈球菌、肺炎球菌、葡萄球菌；G-球菌：淋球菌、腦膜炎球菌；G+桿菌：破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、白喉?xiàng)U菌、炭疽桿菌。. 2、頭孢菌素：第一代對(duì)G 菌為主，對(duì)耐藥金

20、葡有效；第二代G 、對(duì)G 菌作用強(qiáng)，+-對(duì)綠膿桿菌無效；第三代廣譜，對(duì)厭氧菌及綠膿桿菌有效，對(duì)-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定；第四代為廣譜，高效抗菌劑，對(duì)綠膿桿菌和金葡有強(qiáng)效。. 3、紅霉素：窄譜。對(duì)G 菌作用強(qiáng)大；對(duì)G 菌有效；對(duì)軍團(tuán)菌和彎曲桿菌敏感。+-. 4、鏈霉素：窄譜。對(duì)結(jié)核桿菌效果突出；對(duì)G 菌有強(qiáng)大作用；對(duì)G 菌作用弱。-+. 5、慶大霉素：較廣譜。對(duì)G 菌有良好抗菌作用，尤其對(duì)綠膿桿菌作用強(qiáng)；對(duì)G 菌-+中金葡菌有高效。. 6、卡那霉素：窄譜。對(duì)G+球菌（耐藥金葡菌）有強(qiáng)大作用；對(duì)結(jié)核桿菌作用弱；對(duì)綠膿桿菌無效。. 7、四環(huán)素：廣譜。對(duì)G 、G 菌有效。+-. 8、氯霉素：廣譜。對(duì)G 菌作用強(qiáng)

21、；對(duì)G 菌作用不及青霉素與四環(huán)素。-. 9、兩性霉素B、克霉唑、咪康唑、酮康唑：廣譜抗真菌。主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)基適用性檢查3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)2015版2010版1. 術(shù)語變化：計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)1. 術(shù)語變化：計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。2. 需氧菌總數(shù)測定用五種菌株試驗(yàn)。證。2. 細(xì)菌數(shù)測定用三種菌株試驗(yàn)。3. 菌液加入方式：菌液加入供試液中，使每1mL供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu，且所加菌液的體積不超過供試液體積的1。3. 菌液加入方式：平皿計(jì)數(shù)驗(yàn)證時(shí)菌液和供試液同時(shí)加入平皿，加菌量為50100cfu。備注：培養(yǎng)時(shí)間、判斷標(biāo)準(zhǔn)同培養(yǎng)基適用性

22、檢查。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)2010版2015版1. 增加MPN法的檢驗(yàn)，同時(shí)增加其適用性試驗(yàn)的相關(guān)內(nèi)容。2. 用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌進(jìn)行適用性試驗(yàn)。MPN 法 不涉及3. 判斷標(biāo)準(zhǔn):試驗(yàn)組的菌落數(shù)應(yīng)在稀釋劑對(duì)照組菌落數(shù)的95%置信限內(nèi)。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品分類及供試液制備2010版2015版1. 液體供試品2. 固體、半固體或黏稠性供試品1. 水溶性供試品2. 水不溶性非油脂類供試品3. 需用特殊方法制備的供試液的供 3. 油脂類供試品試品：非水溶性、膜劑、 4. 需用特殊方法制備供試液的腸溶及結(jié)腸溶制劑、氣霧劑與 供試品 ：膜劑、腸溶噴霧劑、貼劑、具抑菌活 及結(jié)腸溶制

23、劑、氣霧劑噴性的供試品。霧劑、貼膏劑。備注：編排上供試液制備2015年版移至計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)部分，從結(jié)構(gòu)上更合理。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)-供試液制備用稀釋液2010版2015版1. pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液2. pH7.2磷酸鹽緩沖液1. pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液2. pH7.2磷酸鹽緩沖液3. pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）。3. pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 4. 增加胰酪胨大豆液體培養(yǎng)基。（用于結(jié)腸溶制劑） 不局限上述稀釋液。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需前處理驗(yàn)證前處理方法對(duì)污染

24、菌檢出的影響。樣品有抑菌作用 去除抑菌作用驗(yàn)證抑菌活性的去除判斷樣品是否有抑菌作用。不需前處理效果，以及去除方法對(duì)污染菌生長、檢出的影響。無抑菌作用檢查藥品微生物檢驗(yàn)方法驗(yàn)證的的一般程序與環(huán)節(jié)General procedure and key points in method validation of pharmaceuticalmicrobial tests（中檢院2008年）計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中國藥典 2010版2015版平皿法供試液和菌液同時(shí)加入平皿中試驗(yàn)組供試液中加入規(guī)定量的菌液供試品 供試液直接加入平 供試液，以稀釋液代替菌液按試驗(yàn)對(duì)照組 皿中 組操作取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋

25、液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加入規(guī)定量的試驗(yàn)菌液菌液 直接加入菌液到平對(duì)照組 皿中中和劑對(duì)照組取相應(yīng)量稀釋液代替供試品同試驗(yàn)組操作。稀釋劑對(duì)照組計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 試驗(yàn)組：稀釋度依據(jù)樣品特性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液根據(jù)供試品的理化分裝5份+ 0.1ml枯草芽孢桿菌液+ 0.1ml白色念珠菌液+ 0.1ml黑曲霉菌液特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備合適的供試液。9.9ml供試液計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 菌液對(duì)照組：+0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液分裝

26、5份+ 0.1ml枯草芽孢桿菌液+ 0.1ml白色念珠菌液+ 0.1ml黑曲霉菌液不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液9.9ml稀釋液計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52 范圍內(nèi)若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。 如果供試品對(duì)微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)抗菌活性的去除或滅活1增加稀釋劑和培養(yǎng)基的用量；2加入中和劑或滅活劑；3采用薄膜過濾法和沖洗；4綜

27、合上述措施。 刪除了離心沉淀法。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn). 常見的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法亞硫酸氫納戊二醛、汞制劑酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類稀釋劑、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍 卵磷脂類化合物季銨類化合物（QACs）、碘、對(duì)羥基苯甲酸聚山梨醇酯水銀巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對(duì)氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺酶水銀、汞化物、醛類乙二胺四乙酸（EDTA）、磺胺類-內(nèi)酰胺類抗生素計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn) 中和劑或滅活劑對(duì)照組：+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液中和劑分裝5份稀釋液+ 0.1ml枯草芽孢桿菌液+ 0.1ml白色念珠菌液+

28、 0.1ml黑曲霉菌液9.9ml稀釋液稀釋液計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)影響因素1. 試驗(yàn)菌自然屬性：試驗(yàn)菌用革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、霉菌和酵母菌。2. 菌液的制備：菌液制備及儲(chǔ)存應(yīng)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化，滿足使用的菌液（群體）均一性，活性一致性。3. 特定的試驗(yàn)條件：包括緩沖液、溫度、水、光照應(yīng)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化，且經(jīng)過驗(yàn)證。4. 回收測定的關(guān)鍵因素：培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)條件。 方法適用性條件與樣品檢測條件需一致。計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn).MPN稱為最大可能數(shù)(most probable number)：應(yīng)用概率理論來估算細(xì)菌濃度的方法，首先將待測樣品作一系列稀釋，然后每個(gè)稀釋度取3次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)后，出現(xiàn)細(xì)菌生

29、長的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由最大可能數(shù)表查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù),得出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。MPN法適用性試驗(yàn)：1. 依據(jù)計(jì)數(shù)法要求制備供試液。2. 將試驗(yàn)菌懸液分別接種到供試液中，加入后菌液濃度不大于100cfu/ml 。3. 按照10倍稀釋法稀釋以上接種目標(biāo)菌后的供試液，每種稀釋度制備3管，共3個(gè)稀釋度，9支供試液。4. 將以上接種管置于3035培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天。MPN法適用性試驗(yàn)：5. 菌液對(duì)照組依據(jù)以上方法進(jìn)行操作，僅將供試液用稀釋液進(jìn)行替換即可。同時(shí)用平皿計(jì)數(shù)法確定加入試驗(yàn)組及菌液組的接種量，接種量應(yīng)不大于100cfu/ml。6. 讀取試驗(yàn)組和菌液對(duì)照

30、組的MPN值，判斷試驗(yàn)組的MPN值是否在菌液對(duì)照組95%置信區(qū)間內(nèi)，如果是，則方法適用性試驗(yàn)通過，否則需要重新進(jìn)行優(yōu)化。MPN法適用性試驗(yàn)圖示一：取1ml，約含試驗(yàn)菌104cfu取10ml 1:10的稀釋液試管中，制備3管金黃色葡萄球菌液管1:10供試液100ml1:10試驗(yàn)組取10ml加至90ml稀釋液中，搖勻取10ml 1:100的稀釋液試管中，制備3管3035培養(yǎng) 試驗(yàn)組1:100供試液100ml1:100試驗(yàn)組取10ml加至90ml稀釋液中，搖勻取10ml 1:1000的稀釋液試管中，制備3管1:1000供試液100ml1:1000試驗(yàn)組MPN法適用性試驗(yàn)圖示二：取1ml，約含試驗(yàn)菌1

31、04cfu取10ml 稀釋液試管中，制備3管金黃色葡萄球菌液管稀釋液100ml菌液對(duì)照組取10ml加至90ml稀釋液中，搖勻3035培養(yǎng)取10ml 1:10的稀釋液試管中，制備3管 菌液對(duì)照組1:10稀釋液100ml1:10菌液對(duì)照組取10ml加至90ml稀釋液中，搖勻取10ml 1:100的稀釋液試管中，制備3管1:100稀釋液100ml1:100菌液對(duì)照組MPN法適用性試驗(yàn)：.MPN法：試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。組別接種結(jié)果3,2,1MPN值1501595%可信限范圍30380菌液組供試品組1供試品組22,1,0不適用適用3,1,043主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)

32、基適用性檢查3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)4供試品檢查供試品檢查2010版2015版刪除內(nèi)容無相關(guān)內(nèi)容描述。在實(shí)際操作過程應(yīng)依據(jù)通則供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以三次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則中“結(jié)果的判斷和檢測報(bào)告”。供試品檢查檢驗(yàn)量中國藥典(SOP2010版)2015版除另有規(guī)定外，一般供試品檢驗(yàn)量為10g或10ml，膜劑為100cm2；貴重或微量包裝藥品 一般隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g的檢驗(yàn)量可以逐減

33、。除另有規(guī) 或10ml；膜劑為100cm2；貴重或微量包裝定外，口服固體制劑不低于 藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。3g，液體制劑采用原液者不得 檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。供試品檢查方法要求2010版2015版按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序 按照計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)進(jìn)行供試液的制備，用稀釋液稀釋 的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需成1:10、1:102、1:103等稀釋級(jí)的 氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總供試液。數(shù)的測定。供試品檢查培養(yǎng)條件2010版2015版1. 描述方式：計(jì)數(shù)方法包括平 1.

34、 描述方式：按計(jì)數(shù)方法適用性試皿法和薄膜過濾法，檢查 驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中時(shí)，按已驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法進(jìn)行 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)供試品細(xì)菌、霉菌和酵母菌 的測定。2. 培養(yǎng)條件：胰酪大豆胨瓊脂平板數(shù)測定。2. 培養(yǎng)條件：細(xì)菌3035培 在3035培養(yǎng)3-5天，沙氏葡養(yǎng)3天，霉菌和酵母菌23 萄糖瓊脂平板在2025培養(yǎng)28培養(yǎng)5天，必要時(shí)可適當(dāng)延長7天。57天；MPN法的供試品接種所有試驗(yàn)管在3035培養(yǎng)35天。供試品檢查陰性對(duì)照試驗(yàn)2010版2015版附錄109頁和110頁：1. 所有檢驗(yàn)活動(dòng)包括適用性試驗(yàn)均需要進(jìn)行陰性對(duì)照。1. 平皿法：取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)

35、基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長。2. 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照組，以稀釋劑代替供試品，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。供試品檢查時(shí)也需進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)。如果對(duì)照有菌生長，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。2. 薄膜過濾法：取試驗(yàn)用稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作不得有菌生長。供試品檢查菌數(shù)報(bào)告規(guī)則2010版2015版附錄109頁：1、平皿法：1. 平皿法：細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu 、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋劑，作為菌數(shù)報(bào)告需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu 的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100

36、cfu 的稀釋級(jí)，作為（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的 菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、 算1g、1ml 或10cm2 供試品中所含的微生物1ml 或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。 數(shù)。取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平皿均無菌落生長，或僅最如各稀釋級(jí)的平皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。低稀釋級(jí)的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。供試品檢查菌數(shù)報(bào)告規(guī)則2010版2015版2、薄膜過濾法：計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過

37、100cfu。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml 或10cm2 供試品），或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。附錄110頁：2. 薄膜過濾法：以相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2），或以1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。供試品檢查菌數(shù)報(bào)告規(guī)則2010版2015版3、MPN法：記錄每一稀釋級(jí)微生物生長的管數(shù)，從表 查對(duì)每 或 供試品中需氧無31g 1ml菌總數(shù)的最可能數(shù)。主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)基適用性檢

38、查3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品檢查45結(jié)果判斷結(jié)果判斷計(jì)數(shù)要求2010版2015版營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)(包括真菌菌落數(shù))；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)(包括細(xì)菌菌落數(shù))。于霉菌與酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。結(jié)果判斷計(jì)數(shù)干擾2010版2015版若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)

39、進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用 MPN法，測定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。若營養(yǎng)瓊脂上生長霉菌與酵母菌、玫瑰紅鈉上生長細(xì)菌，則分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂上霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉上細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉上霉菌和酵母菌或營養(yǎng)瓊脂上細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。結(jié)果判斷計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)W、美藥典，增加菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定結(jié)果以10ncfu表示時(shí)，限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：“101CFU：最大可接受限值=20；102CFU：最大可接受限值=200；103CFU：最大可接受限值=2000。以此類推?！保ㄈ站址絏 V無相應(yīng)內(nèi)容）若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定

40、，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。結(jié)果判斷計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)例如，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)為101cfu，不同于以往10cfu規(guī)定。以10的指數(shù)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，考慮了微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的可變性，即計(jì)數(shù)結(jié)果的，而非類似化學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果。故要求我們需要在結(jié)果判斷時(shí)或制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，對(duì)于結(jié)果的判斷或歷史數(shù)據(jù)的分析需要用風(fēng)險(xiǎn)分析的手段進(jìn)行評(píng)估。制定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需要依據(jù)歷史數(shù)據(jù)、工藝過程、用藥人群等進(jìn)行相應(yīng)分析，制定合理的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，即總原則為在內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)的控制下產(chǎn)品無任何質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。主要內(nèi)容12格式和通用要求變化培養(yǎng)基適用性檢查3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品檢查456結(jié)果判斷新理念計(jì)數(shù)檢查法1、2015版的非無菌產(chǎn)

41、品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法概念明確，體例更合理;2、2015版的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法方法科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、更具操作性；3、2015版的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：計(jì)數(shù)檢查法達(dá)到了與國際接軌的目的，又兼顧了國情;4、檢驗(yàn)理念的變化微生物檢驗(yàn)結(jié)果引入偏差調(diào)查。新理念偏差調(diào)查：1. 當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)超?；虺瑯?biāo)時(shí)均需要進(jìn)行偏差調(diào)查。2. 調(diào)查范圍人、機(jī)、料、法、環(huán)。偏差調(diào)查的范圍至少包括： 微生物鑒別-初步確定污染源 原始數(shù)據(jù)以及陰陽性對(duì)照回顧。 培養(yǎng)基及所用的其他耗材是否滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。 取樣環(huán)境是否滿足要求。 同期進(jìn)行檢驗(yàn)的其他結(jié)果是否正常。 消毒劑是否在有效期內(nèi)，且消毒是否正確。 必要

42、情況下進(jìn)行相應(yīng)的重試。微生物質(zhì)控體系2015版藥典理念轉(zhuǎn)變結(jié)果判定科學(xué)化傳統(tǒng)檢查與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合考慮基本國情與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌觀念轉(zhuǎn)變總結(jié)：檢驗(yàn)程序1、培養(yǎng)基適用性檢查；2、方法適用試驗(yàn)前評(píng)估；3、通過評(píng)估，采用規(guī)定的稀釋液制備樣品；4、試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組、供試品對(duì)照組、中和劑或滅活劑對(duì)照組（需要的話）制備；培養(yǎng)、觀察、計(jì)數(shù)；計(jì)算回收率；5、判斷回收率結(jié)果是否滿足要求：是，方法適用性試驗(yàn)通過，進(jìn)行確認(rèn)；否，重新選擇方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。6、按通過的方法建立SOP進(jìn)行樣品檢驗(yàn)。2015版案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性樣品：多潘立酮片方法適用試驗(yàn)前評(píng)估： 根據(jù)處方進(jìn)行分析，產(chǎn)品中是否有抑菌成分

43、； 參照歷史上曾經(jīng)進(jìn)行過的方法驗(yàn)證，根據(jù)歷史數(shù)據(jù)判斷產(chǎn)品是否有抑菌性； 也可以通過預(yù)試驗(yàn)判斷樣品中是否有無抑菌性。通過以上判斷，起草方法適用性試驗(yàn)草案，確定方法適用性試驗(yàn)具體過程。案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性通過以上評(píng)估，判斷多潘立酮片無抑菌性，可以采用規(guī)定的稀釋液制備方法，采用平皿法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，具體如下：1.樣品制備：稱取供試品10g，加至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基90ml中，制 成1：10的稀釋液；2.試驗(yàn)組：吸取1：10的稀釋液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌懸液后搖勻；3.菌液對(duì)照組：吸取稀釋液胰酪大豆胨肉湯9.9ml，共5份，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖

44、勻；案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性4. 試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組搖勻后，分別從所有試驗(yàn)菌試管中吸取1ml注入直徑90mm的平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另分別吸取1ml注入直徑90mm的平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每種試驗(yàn)菌平行2份。5. 供試品對(duì)照組：吸取1：10的供試液1ml注入直徑90mm的平皿中，平行四份，其中兩個(gè)平皿中注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基, 另兩個(gè)注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。6. 將以上平皿分別置3035 或2025 培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)不超過3天，真菌培養(yǎng)不超過5天，在3天和5天分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性7. 結(jié)果計(jì)算：判斷試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照

45、組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組的比值是否在0.52范圍內(nèi)。如果是，則方法適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。8. 建議：生產(chǎn)企業(yè)根據(jù)以上方法進(jìn)行確認(rèn)。9. 如果均滿足要求，則該方法適用性試驗(yàn)通過，建立SOP用于日常檢驗(yàn)。案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果需氧菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（0.52）菌液對(duì)照組菌種稀釋度: 1:103天 5天3天5天3天5天金黃色葡萄球菌53/42/0.8/銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌474437/416335/0.91.40.91.1/37350.9/黑曲霉69 蔓延74 蔓延供試品對(duì)照組:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2陰性對(duì)照組:胰酪大豆胨

46、瓊脂培養(yǎng)基: CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2案例分析 -無抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果霉菌和酵母菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（0.52）菌液對(duì)照組稀釋度: 1:10菌種3天5天3天255天3天5天0.7/白色念珠菌黑曲霉408146340.61.0蔓延83蔓延供試品對(duì)照組:沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2陰性對(duì)照組:沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性樣品：曲安奈德益康唑乳膏方法適用性試驗(yàn)評(píng)估： 根據(jù)處方及歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，產(chǎn)品中益康唑?qū)γ咕?、酵母和部分陽性桿菌均具有抑菌性。 根據(jù)歷史數(shù)據(jù)分析，曲安奈德益

47、康唑乳膏對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、霉菌均有一定的抑菌性，需要進(jìn)行稀釋，加入中和劑對(duì)抑菌性中和后進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 考慮該樣品為外用藥，其限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)不大于101cfu/g。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性如果采用稀釋法，需氧菌總數(shù)的稀釋度不大于1:100，霉菌和酵母菌總數(shù)的稀釋度不大于1:10，否則超過2個(gè)菌落生長，樣品則不能滿足限度標(biāo)準(zhǔn)要求。根據(jù)以上判斷，初步設(shè)定的方法適用性試驗(yàn)如下：1. 樣品制備：稱取供試品10g加入含有中和劑聚山梨酯80 5%的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基90ml中，制成1：10的供試液；吸取1：10的供試液20ml加入80

48、ml含有中和劑聚山梨酯80 5%的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻制成1：50供試液。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性2. 試驗(yàn)組：吸取1：50的供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌懸液后搖勻，用于需氧菌總數(shù)測定；另吸取1：10的供試液9.9ml，共2份，每份中加入0.1ml的試驗(yàn)菌菌懸液后搖勻，用于霉菌和酵母菌總數(shù)測定。3. 中和劑對(duì)照組：吸取含有中和劑聚山梨酯80 5%的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入與試驗(yàn)組相同的試驗(yàn)菌菌懸液后搖勻。4. 菌液對(duì)照組：吸取稀釋液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的試驗(yàn)菌菌懸液后搖勻。案例分析 -有

49、抑菌性樣品方法適用性5. 試驗(yàn)組、中和劑對(duì)照組和菌液對(duì)照組搖勻后，分別從需氧菌總數(shù)測定用試驗(yàn)菌試管中吸取1ml加入直徑14cm的平皿中，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從霉菌和酵母菌總數(shù)測定用試管中分別吸取1ml加入直徑14cm的平皿中，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種試驗(yàn)菌平行2份。6. 供試品對(duì)照組：吸取1：50的供試液1ml加入直徑14cm的平皿中，平行兩份，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；吸取1：10的供試液1ml加入直徑14cm的平皿中，平行兩份， 加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。7. 將以上胰酪大豆胨瓊脂平皿放入3035 培養(yǎng),時(shí)間不超過3天；沙氏葡萄糖瓊脂平皿放入2025 培養(yǎng)，時(shí)間不超過5

50、天，并分別于3天和5天進(jìn)行計(jì)數(shù)。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性8. 結(jié)果計(jì)算： 試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值是否在0.5 2范圍內(nèi)； 中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5 2范圍內(nèi)。如果以上均滿足要求，則適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。9. 建議：生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)以上方法進(jìn)行確認(rèn)。如果均滿足要求，則該方法驗(yàn)證成功。10.建立該品種的SOP，用以日常檢驗(yàn)。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果需氧菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（ ）中和劑對(duì)照組菌液對(duì)照組稀釋度為1:500.52菌種3天795天3天735天3天5天3天5天金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌/7363/

51、0.9（0.9）/18383（0.8）枯草芽孢桿菌白色念珠菌437622/310/407030/0.7（0.9）7664*15*700（0.9） 0.8（0.9）黑曲霉蔓延0蔓延 0.7（1.4）/供試品對(duì)照組:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2陰性對(duì)照組:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2備注：五天計(jì)數(shù)時(shí)，試驗(yàn)組白色念珠菌、黑曲霉菌菌落比菌液對(duì)照組小。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果霉菌和酵母菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（0.52）中和劑對(duì)照組菌液對(duì)照組稀釋度: 1:10菌種3天5天3天5天3天5天3天5天白色念珠菌黑曲霉72347

52、30000633664000/蔓延蔓延供試品對(duì)照組:沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2陰性對(duì)照組:沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2備注：適用性試驗(yàn)中，供試品試驗(yàn)菌生長微弱或者不生長是由產(chǎn)品的抗菌活性引起。最終試驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)限度內(nèi)允許的最高稀釋度供試液。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性樣品：酮康唑洗劑方法適用性試驗(yàn)評(píng)估： 根據(jù)處方及歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該產(chǎn)品為抗真菌藥，對(duì)白色念珠菌抑菌性或殺菌性。 根據(jù)歷史數(shù)據(jù)分析，酮康唑洗劑對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有一定的抑菌性，需要進(jìn)行稀釋，加入中和劑對(duì)抑菌性中和后進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。 考慮該樣

53、品為外用藥，其限度標(biāo)準(zhǔn)為需氧菌總數(shù)不大于102cfu/g、霉菌和酵母菌總數(shù)不大于101cfu/g。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性如果采用稀釋法，需氧菌總數(shù)的稀釋度不大于1:100，霉菌和酵母菌總數(shù)的稀釋度不大于1:10 ，否則超過2個(gè)菌落生長，樣品則不能滿足限度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。根據(jù)以上判斷，初步設(shè)定的方法實(shí)用性試驗(yàn)如下：1. 樣品制備：稱取供試品10g加入含有中和劑聚山梨酯80 5%的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，制成1:10的供試液；吸取1:10的供試液20ml加入80ml含有中和劑聚山梨酯80 5%的的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，搖勻制成1:50供試液。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性2. 試驗(yàn)

54、組：吸取1:50的供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌菌懸液后搖勻，用于需氧菌總數(shù)測定；另吸取1:10的供試液9.9ml，共2份，每份中加入0.1ml的要求試驗(yàn)菌菌懸液后搖勻，用于霉菌和酵母菌總數(shù)測定。3. 中和劑對(duì)照組：吸取含有中和劑聚山梨酯80 5%的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。4. 菌液對(duì)照組：吸取稀釋液胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，每份中加入與試驗(yàn)組相同的菌懸液后搖勻。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性5. 試驗(yàn)組、中和劑對(duì)照組和菌液對(duì)照組搖勻后，分別從所有需氧菌總數(shù)測定用試管中吸取1ml加入直徑90mm的平皿中，加入胰

55、酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從霉菌和酵母菌總數(shù)測定用試管中分別吸取1ml加入直徑90mm 和直徑14cm的平皿中，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種試驗(yàn)菌平行2份。6. 供試品對(duì)照組：吸取1:50的供試液1ml加入直徑90mm的平皿中，平行兩份，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；吸取1:10的供試液1ml加入直徑90mm 和直徑14cm的的平皿中，每種平皿分別平行兩份， 加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，搖勻。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性7.將以上胰酪大豆胨瓊脂平皿放入3035 培養(yǎng)，時(shí)間不超過3天；沙氏葡萄糖瓊脂平皿放入2025 培養(yǎng)，時(shí)間不過5天，分別于3天和5天進(jìn)行計(jì)數(shù)。8. 結(jié)果計(jì)算： 試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供

56、試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組的比值是否在0.5 2范圍內(nèi)。 中和劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5 2范圍內(nèi)。如果以上均滿足要求，則適用性試驗(yàn)結(jié)果滿足要求。9. 建議：生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)以上方法進(jìn)行確認(rèn)。如果均滿足要求，則該方法驗(yàn)證成功。10.建立該品種的SOP，用以日常檢驗(yàn)。案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果需氧菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（ ）中和劑對(duì)照組菌液對(duì)照組稀釋度為1:500.52菌種3天435天3天36181105天3天5天3天5天金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌/4317445436/0.8（1）0.9（0.8）0.2（0.7）/20/61/525

57、2蔓延0/55蔓延0（1.0） 0（1.0）黑曲霉4126（0.6 0.9/）供試品對(duì)照組:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2陰性對(duì)照組:胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基: 0 CFU/平皿1, 0 CFU/平皿2案例分析 -有抑菌性樣品方法適用性試驗(yàn)結(jié)果霉菌和酵母菌總數(shù)：試驗(yàn)組比值（0.52）中和劑對(duì)照組菌液對(duì)照組稀釋度: 1:10菌種3天5天3天5天3天5天3天5天白色念珠菌( 9cm )黑曲霉( 9cm )5619582756蔓延59011004820652648蔓延670（0.8） 0（0.8）0.6（1.0）0（1.1） 0（1.1）0.6（1.0）蔓延0/白色念珠菌( 14cm )