2013年中銷售會(huì)議-培訓(xùn)mirna

1、2013上半年銷售培訓(xùn)microRNA( Array & Seq )ho種類長(zhǎng)度（nt）來(lái)源主要功能siRNA21-25長(zhǎng)雙鏈RNA轉(zhuǎn)錄沉默含發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pri-miRNA長(zhǎng)單鏈前體或起始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等多途徑miRNA21-25轉(zhuǎn)錄沉默piRNA24-31生殖細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座子的沉默組印記和X失lncRNA200多種途徑活于紅. 表觀遺傳學(xué)：生物細(xì)胞非編碼RNA調(diào)控的研究進(jìn)展. 遺傳. 2009年11月，31（11）22miRBase Release 20 contains 24521 entries representing hairpin precursormiRNAs, expressing 304

2、24 mature miRNA products, in 206species.microRNA數(shù)目與文獻(xiàn)呈指數(shù)遞增黑色：miRBase中microRNA數(shù)目；灰色：Pubmed中microRNA相關(guān)文獻(xiàn)Kozomara A , Griffiths-Joneucl. Acids Res. 2011;39:D152-D157完全匹配，靶基因mRNA降解不完全匹配結(jié)合在 3UTR，抑制靶基因蛋白翻譯裝配形成miRISC核DNA轉(zhuǎn)錄pri- miRNA雙鏈RNA,形成成熟miRNA經(jīng)Dicer切割莖環(huán),形成雙鏈小RNA經(jīng)過(guò)Drosha切割，形成6070nt長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)pre- miRNA通過(guò)Exp

3、ortin5進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)hsa-mir-19a*hsa-miR-19b-1*hsa-miR-19b-2*hsa-mir-19hsa-miR-19b-2-5phsa-mir-19b-2hsa-miR-19b-3phsa-mir-19b-1hsa-miR-19b-1-5phsa-mir-19a-3phsa-mir-19ahsa-mir-19a-5p安捷倫是國(guó)際領(lǐng)先的生物制造企業(yè)。它生產(chǎn)的microRNA通過(guò)獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)能區(qū)分成熟miRNA和miRNA前體，同時(shí)具有特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)。特別適用于血漿microRNA的檢測(cè)。Agilent microRNA獨(dú)特的探針設(shè)計(jì)6Agilent micr

4、oRNA技術(shù)特點(diǎn)：通過(guò)特殊的探針設(shè)計(jì)區(qū)分成熟miRNA和miRNA前體；無(wú)需分離miRNA，直接用Total RNA 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，只需100ng的Total RNA 即可用來(lái)進(jìn)行標(biāo)記實(shí)驗(yàn)；組織、血漿、FFPE、冰凍切片組織、脫落細(xì)胞等均可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；高特異性：特殊的專利探針設(shè)計(jì)能區(qū)別一個(gè)堿基的差異；高靈敏度：檢測(cè)豐度跨4個(gè)log，最高可達(dá)6個(gè)log，只要存在6000個(gè)拷貝的分子就可以檢出；數(shù)據(jù)來(lái)源于Sanger miRBase，并方便及時(shí)更新。Agilent miRNA*去除背景信號(hào)，非質(zhì)控重復(fù)探針中位值變異系數(shù)百分比質(zhì)控tCVBGSubSig *15樣本Total RNA including m

5、iRNA起始用量100ngFFPEAgilent miRNA MicroarrayComparison of the differentially expressed miRNAs acrossthe different storage conditions revealst moren 70nIllustrate the tight correlation of the human miRNA profilespercent of the miRNAs differentially expressed betthe normal and tumor freshfrozen sfound to

6、 be differentially expressedles were alsohe FFPE sles.MicroRNAysis of Archival FFPE Sles by MicroarrayPublication Number: 5990-4944EN Last Updated: 2013/4/24FFPEAgilent miRNA MicroarraytCVBGSubSig(0X2.5)Hybe-InSignal(2.5)3.703.603.503.403.303.203.106.004.002.003.353.540.00FF(n=100)FFPE(n=100)FF(n=10

7、0)FFPE(n=100)Agilent miRNA16.0數(shù)據(jù)4.424.326.418.6521.9125.40Affymetrix microRNA 3.0技術(shù)特點(diǎn)：1.完Sanger miRBase V17.0同時(shí)檢測(cè)153個(gè)物種的miRNA同時(shí)檢測(cè)成熟miRNA和miRNA前體（僅限人、小鼠、大鼠）能檢測(cè)人snoRNA和scaRNA45分鐘完成標(biāo)記，無(wú)需擴(kuò)增、純化RNA高靈敏度：miRNA濃度大于1.0amol時(shí)，檢出率達(dá)94%高重復(fù)性：技術(shù)重復(fù)相關(guān)系數(shù)達(dá)95%低樣品需求量：最低僅需130ng總RNA檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍為3個(gè)log尋找microRNA生物標(biāo)志物microRNA的功能分析HO

8、T！1515復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌教授領(lǐng)銜課題組利用Agilent microRNA篩選、RT-PCR驗(yàn)證等方法在肝癌患者血漿中篩選到了由7個(gè)microRNA組成的早期肝癌分子標(biāo)記物該檢測(cè)方法對(duì)小于2cm的肝癌效果優(yōu)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法。準(zhǔn)確率接近90%，于國(guó)際臨床腫瘤領(lǐng)域最的學(xué)術(shù)期刊臨床腫瘤學(xué)雜志上（影響因子為18.97）microRNA完成。技術(shù)服務(wù)由生物技術(shù)Jian Zhou, Lei Yu, Xue, Jie Hu, JiWang, Zhi Dai, Jie-Fei Wang, Zhiyong Zhang, Shaohua Lu,Xiaowu Huang, Zheng Wang, Shuang

9、jian Qiu, Xiaoying Wang, Guohuan, Huichuan Sun, ZhaoyouTang, Ying Wu, Hongguang Zhu and Jia Fan. Plasma MicroRNA Panel to Diagnose Hepa/s B Related Hepatocellular Carcinoma. Journal of Clinical Oncology. November 21, 20111616大樣本篩選RT-PCR驗(yàn)證ROC分析HCC：hepatitis Brelated HCC，肝癌Healthy：正常CHB：chronic hepati

10、tis B，慢性乙型肝炎Cirrhosis：肝硬化1717HCC VS HealthyHCC VS CHBHCC VS CirrhosisHuman Agilent microRNA Array 12.0137 例血漿樣品篩選得到15個(gè)候選microRNART-PCR驗(yàn)證后，確定為7個(gè)microRNA譜1818ROC分析：受試者工作特征（receiver operating characteristic）AUC：ROC曲線下面積，準(zhǔn)確性的衡量標(biāo)準(zhǔn)MicroRNA Panel肝癌（Training7個(gè)microRNA單獨(dú)肝癌的準(zhǔn)確率Set）時(shí)，AUC值達(dá)0.864MicroRNA Panel：l

11、ogit(p=HCC) = 1.424 0.292miR-122 + 0.4511miR- 192 + 0.6112miR-21 0.1796miR-223 0.2487miR-26a 0.3542miR-27a + 0.209miR-8011919MicroRNA Panel區(qū)分肝癌與正常人群的準(zhǔn)確率達(dá)94.1%MicroRNA Panel區(qū)分肝癌與肝炎的準(zhǔn)確率達(dá)84.2%該肝癌模型準(zhǔn)確率高，檢測(cè)方便，適合臨床應(yīng)用！M20icroRNA Panel區(qū)分肝癌與肝硬化的準(zhǔn)確率達(dá)88.4%20miRNA：Agilent-v1 (570 miRNAs）mRNA：Affymetrix 430 v2.0

12、 aged mice：1820months oldyoung mice ：68ks old端粒短調(diào)亡高化人類心臟中表達(dá)量心肌細(xì)胞非心肌細(xì)胞文獻(xiàn)：miR-34a 在腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡 衰老？細(xì)胞收縮機(jī)能收縮機(jī)能Affymetrix mouse 430 v2.0細(xì)胞心臟肥大AMI后其表達(dá)量變化局部心室壁運(yùn)動(dòng)評(píng)分收縮機(jī)能miR-34a的靶結(jié)合表達(dá)譜分析PNUTS蛋白抑制：調(diào)亡、端?？s短及DNA損傷反應(yīng)miR-34a與PNUTS的直接作用的證明實(shí)驗(yàn)細(xì)胞局部心室壁運(yùn)動(dòng)評(píng)分DNA損傷端粒長(zhǎng)度microRNA研究已知miRNA數(shù)量有限microRNA發(fā)現(xiàn)未知miRNA數(shù)量較多miRNA-seq文庫(kù)構(gòu)建

13、流程去除接頭，低質(zhì)量序列需要參考信息組數(shù)據(jù)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)過(guò)濾需要參考組或完整轉(zhuǎn)錄組信息鑒定已知miRNA和ncRNA新miRNA高級(jí)分析差異miRNA篩選與miRBase，ncRNA， pirna，Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，飽和度分析靶GO注釋和KEGG通靶路分析樣品或物種間 miRNA差異分析miRNA和靶聚類分析表達(dá)模式SAS分析系統(tǒng)其他個(gè)性化分析長(zhǎng)期的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，肝炎、肝硬正常肝組織化、肝癌是不斷遷移演變的。HCV肝癌組織未的近來(lái)研究表明，與肝癌(HCC)有關(guān)的性肝炎 主要包括乙型肝炎 （HBV）、丙型肝炎（HCV），而其中又以乙型肝炎最為常見(jiàn)。肝癌組織miRNA表達(dá)譜HBV肝癌組織

14、乙型肝炎的肝組織microRNA與多種疾病包括的發(fā)HBV的肝組織生發(fā)展機(jī)制的研究是近年來(lái)生物醫(yī)學(xué)界的前沿?zé)狳c(diǎn)課題。Jin Hou,et al. Cancer Cell. 2011(19) :232243正常肝臟組織最高表達(dá)的三個(gè)miRNA，僅miR-199a/b-3p在肝癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。在四個(gè)肝癌患者群體臨床陣列分析發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p低表達(dá)豐度顯著降低肝癌患者的生存期。1.甲基化和CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：肝癌組織中組蛋白的甲基化改變導(dǎo)致了miR-199a/b-3p低表達(dá)2.肝癌細(xì)胞系的體外miR-199a/b-3p干擾實(shí)驗(yàn)和肝癌鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p的高表達(dá)顯

15、著抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。3.肝靶向相關(guān)載體介導(dǎo)的microRNA-199治療，顯著延長(zhǎng)了肝癌鼠生存期。4.miR-199a/b-3p靶向抑制PAK4(p21-activated kinase 4,為一類進(jìn)化上保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶), 進(jìn)而抑制下游的Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，從而抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Cell子刊：miRNA與miRNAs表達(dá)的特異性和時(shí)序性，決定了組織和細(xì)胞的功能特異性miRNAs在適應(yīng)生物和非生物脅迫中有著重要的作用水稻miRNA表達(dá)譜研究不完善。62個(gè)小 RNA測(cè)序文庫(kù)不同水稻不同環(huán)境不同組織幼苗根 芽穗組織干旱鹽堿營(yíng)養(yǎng)溫度Illumina高通量小 RNANipponbareOsDCL1 RNAiMassiveysis of Rimall RNAs: Mechanistic Implications of Regulated MicroRNAs and RNA Cleavage. Plant Cell 2011 23(12): 4185-4207.Var