STRPCR半定量檢測嵌合體方法在非清髓異基因造血干細胞移植中的

1、STR-PCR半定量檢測嵌合體要領在非清髓異基因造血干細胞移植中的【摘要】目的應用STR-PR半定量嵌合體檢測要領監(jiān)測非清髓異基因造血干細胞移植nn-yelablativeallgenEisteelltansplantatin，NAST后嵌合體。要領接納短串聯重復序列-聚合酶鏈反響STR-PR結合聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色以及凝膠成像闡發(fā)技能對28例擔當NAST的患者舉行嵌合體監(jiān)測。效果27例患者形成造血細胞嵌合體，完全嵌合pletehieris，22例，混淆嵌合ixedhieris，5例；此中低比例嵌合llevelfixedhieris，L3例，高比例嵌合highlevelfixedhier

2、is，H2例。不變植入的患者+7天即達H，3例患者復發(fā)前檢測到供體細胞嵌合率dnrell，D落落，1例在狀態(tài)下復發(fā)，1例L產生早期移植排擠，恒久存活者均保持不變。嵌合體監(jiān)測下早期擔當臨床干預治療的患者轉化為并延伸了無病保存期。結論STR-PR是一種簡樸、敏感、經濟的監(jiān)測非清髓移植后嵌合體的要領。熊輝霞1977，女，漢族，青海籍，主治醫(yī)師，碩士【關鍵詞】短串聯重復序列非清髓造血干細胞移植造血嵌合體KeyrdsshrttanderepeatsNn-yelablativesteelltransplantatinNeatpietihieris非清髓異基因造血干細胞移植NAST由于減量的放、化療預處置懲

3、罰加上強效的免疫按捺，移植后多形成供、受體細胞差異比例的混淆嵌合體，并呈動態(tài)變革1,2。嵌合體監(jiān)測對闡發(fā)植入狀態(tài)，斷定疾病復發(fā)及引導移植后續(xù)治療具有緊張意義。短串聯重復序列STR是如今檢測嵌合體最常用的遺傳標識表記標幟，我們接納STR-PR半定量要領對28例擔當NAST的患者舉行了嵌合體的檢測，現陳訴如下。1資料與要領1.1病例資料不雅察工具為2022年至2022年在東南大學隸屬中大病院血液科擔當NAST的患者28例，男19例，女9例，年事15歲58歲，中位年事37歲。此中慢性粒細胞白血病L19例，慢性淋巴細胞白血病(LL)1例，急性非淋巴細胞白血病(AL)3例，骨髓增生非常綜合征(DS)4例

4、，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)1例。同胞供者24例，無血緣干系供者2例,HLA配型均為全相合；單倍型親緣供者2例，均為DR位點不合。供、受者性別相合18例，性別不合10例。AB血型相合21例，血型不合7例。1.2要領術前網羅供者和受者外周血2l，術后+7天、+14天、+21天、+30天網羅患者外周血，今后據患者隨訪時間網羅外周血每月1次或每3月1次。行供體淋巴細胞輸注dnrlyphyteinfusin，DLI治療后每15天網羅受者外周血1次，直至可評價的盡頭。移植后早期造血按捺期每次抽血5l，今后每次2l，AD抗凝，于采血后24h內用紅細胞裂解液裂解紅細胞，提取白細胞，用helex-100法快速

5、提取基因組DNA，編號后置-20冰箱保存。本研究選擇STR位點的原那么是：均為四堿基重復序列錯配較少；雜合度較高有較高的個別識別本領；等位基因個數適中，均勻610個易于分型；等位基因頻率在研究人群所屬地域漫衍較好。按文獻3,4選擇D5S818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vA8個位點舉行檢測。先對供、受者術前標本在上述8個位點舉行擴增，對擴增產物行非一連非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色顯影，按照等位基因途徑Ladder比較閱讀列位點的基因型,尋出各組供、受體可區(qū)分互相的有信息位點，按Thiede等5陳訴的要領舉行分類，選擇出類和類位

6、點，術后標本僅在類和類位點擴增，凝膠用UVP成像闡發(fā)體系舉行灰度掃描后用Gel-Pr4.0軟件闡發(fā)，選擇相應的公式以整合光密度ID值盤算供體細胞嵌合率D。完全嵌合體：D95%；混淆嵌合體：5%D95%；高比例嵌合體H：D50%；低比例嵌合體L：D50%。2效果移植1個月后，28例患者中僅1例DS-RA患者未檢測到嵌合體，造血始終未規(guī)復，AN0.1109/L，骨髓增生非常減低，證實移植失敗，于移植后45天死于嚴峻熏染。余27例患者均形成差異比例的供、受者造血細胞嵌合體，此中22例形成；5例形成；2例形成高比例混淆嵌合H；3例低比例混淆嵌合L。全部不變植入的患者在+7天時的均勻嵌合率是74.71%

7、，此時尚處于造血按捺期，+14天多數病例達，均勻嵌合率是95.74%。移植后隨訪1.5月27月，均勻11個月，22例患者中3例患者復發(fā)前檢測到D落落，1例在狀態(tài)下復發(fā)，恒久存活者均保持不變。5例患者中，1例L的LL患者早期出現移植排擠，+1月時STR-PR查抄僅在vA、D7S820、D5S818位點檢測到少量的供者型遺傳標識表記標幟D為27%，但血通例查抄提示造血規(guī)復，思量為早期移植排擠，自身造血規(guī)復，經2次DLI后漸漸到達，并保持不變見圖1；另2例L患者早期復發(fā)，1例殞命，1例經二次尺度移植后得到。2例H患者中的1例為L，移植后1月即為D為54%，實時予DLI1次，DLI后+1.5月時已有治

8、療反響，D上升到80%，出院后患者未能繼承監(jiān)測嵌合體，+4月時出現遺傳學復發(fā)Ph陽性染色體占90%，再次入院，予DLI1次，療效不佳，敏捷出現血液學復發(fā)，嵌合體檢測為完全受者型見圖2。另1例H患者+1月后舉行性落落，脾腫大，骨髓增生顯著活潑，診斷為脾成效亢進，STR-PR查抄一連，DLI后未見D上升，+4月時行脾切除治療，+8月時轉為，并保持不變。3討論STR是一類呈高度多態(tài)性的遺傳標識表記標幟，STR-PR技能敏捷、快速，是如今最常用的檢測嵌合體的要領之一7。國表里有多家移植單元接納熒光標識表記標幟的多重PR結合DNA測序儀和基因掃描軟件步伐檢測嵌合體，固然具有主動化程度高、無交織污染、省時

9、快速等長處，但由于多個位點在同一反響管內擴增，其敏感性閾值較單一位點STR-PR要領的敏感性低，而且對儀器裝備要求高，恒久監(jiān)測用度昂貴，海內難以普及。我們接納STR-PR結合聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色以及凝膠成像闡發(fā)技能檢測嵌合體的要領，起首挑選出能區(qū)別供、受體的有信息的位點，并進一步尋出敏感性較高的闡發(fā)位點，在移植后嵌合體的恒久監(jiān)測中，我們只需選擇對供受者得當的少數位點舉行檢測即可反響充足的臨床信息，而且不需特別的試劑儀器，輕便易行。同時我們還創(chuàng)造，微衛(wèi)星位點的選擇非常緊張，并非全部的信息位點都得當于嵌合體的定量檢測，有些位點在定性闡發(fā)時成心義，但在定量闡發(fā)時意義有限。嵌合體檢測的目的重要是

10、在以供者細胞為條件的條件下創(chuàng)造受者細胞，影響定量闡發(fā)效果的一個緊張因素是等位基因的長度。由于PR時存在以下兩種征象影響擴增服從的同等性：1短片斷優(yōu)先擴增；2平臺效應。因此，在選擇闡發(fā)位點時，應滿意受者等位基因長度小于供者等位基因長度。同時我們進一步創(chuàng)造，假設目的基因是純合子，那么檢測的敏感性更高。但在現實應用中，假設患者和供者的血緣干系非常近，有大概尋不到切合上述條件的STR位點，就不得不選擇一些敏感性較次的位點。我們的研究創(chuàng)造植入樂成的患者在+14天多數達，在之后的隨訪中，凡恒久存活的病例都能保持不變，5例均不不變，有D進一步落落導致移植排擠和復發(fā)的傾向。此效果提示早期供體植入率是影響NAST可否產生移植排擠的緊張因素，+100天內更應增強嵌合體監(jiān)測并實時接納防范方法。STR-PR技能可在嚴峻粒細胞缺乏階段實行，嵌合體檢測固然不克不及直接檢測出殘留的白血病細胞，但由于受體細胞比例增長與移植排擠和復發(fā)的傷害性高度相干8,9，因此可通過定量檢測供體細胞嵌合率，來斷定患者體內殘留的受體細胞程度。DLI是移植后臨床干預治療的緊張構成部門，其誘導的移植物抗白血病效應graftversusleukeiaeffet，GVL在腫瘤細胞負荷低時易發(fā)揮根治性作用，掌握DLI的機