HLA測序技術在非親緣性臍血移植應用價值探討

1、HLA測序技能在非親緣性臍血移植應用代價探究廖燦，楊昕，李焱，黃以寧，許遵鵬，吳潔瑩，湯雪薇，陳勁松，吳韶清【摘要】1998年6月至2022年7月，廣州臍血庫向海內21家移植中央54例患者提供了非親緣性異基因臍血。為了探究非親緣性臍血移植供/受者HLA等位基因及其亞型與臍血移植GVHD產生率的干系，對54例非親緣性臍血移植病例中，半年后有反響隨訪資料的48例，使用鹽析或柱提法提取移植的非親緣性臍血的DNA及移植病例的全血DNA，接納HLA-SBT要領別離對HLA-A、B、DRB1位點舉行了高區(qū)分分型，并與我?guī)炷氀W絡通例接納的HLA-SSPHLA-Sequeningspeifipriers低區(qū)

2、分效果舉行了比力闡發(fā)。效果創(chuàng)造，HLA不合位點不多于2個和HLA不合位點不少于3個的病例GVHD的產生率具有統(tǒng)計學明顯性差異P0.05。在對HLA-A、B、DRB1等位基因高區(qū)分單因素分型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因匹配全相合的病例GVHD產生率明顯低于不完全相合病例GVHD的產生率P=0.000，P=0.005。結論：PR-SBT技能在非親緣性臍血移植HLA配型方面具有緊張的臨床應用代價。【關鍵詞】非親緣性臍血移植；HLA配型;HLA測序技能；HLA-SBT；臍血linialAppliatinfHLASequeninginUnrelatedUbilialrdBldTransp

3、lantatinKeyrdsunrelatedubilialrdbldtransplantatin;HLAisath;HLAsequening;HLAsequeningbasedtyping;ubilialrdbldHLA高區(qū)分分型技能不但可以對HLA血清學配型起到積極的校正作用，對研究哪些HLA等位基因相合可以顯著削弱GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及訂定相對個別化的HLA配型計謀都具有緊張的臨床應用代價。在骨髓造血干細胞移植中，HLA測序分型技能得到了普及的應用和生長，在防范GVHD方面具有非常緊張的意義。本研究接納以測序為底子的HLA分型技能HLA-sequeningbase

4、dtypingHLA-SBT對可隨訪的48例非親緣性臍血移植病例HLA配型效果舉行回首性闡發(fā)，以探究HLA-A/B/DRB1等位基因匹配程度對非親緣性臍血移植GVHD的影響。質料和要領臍血泉源臍血樣本全部來自廣州臍血庫，臍血分散、冷凍、保存以及相干檢測參考相干文獻2。移植供受體選擇54例非親緣性臍血移植供受者樣本及隨訪資料由海內21家移植中央提供，此中6例待隨訪，選擇48例非親緣性臍血移植病例舉行回首性闡發(fā)，移植受者一樣平常環(huán)境見表1。Table1.Generalharateristisf48UBTreipients略急性移植抗宿主病aGVHD的防范48例移植病人均接納環(huán)孢霉素+甲基強的松龍方

5、案防范aGVHD。移植供/受體的DNA提取移植供/受體DNA提取均接納GTDNA提取試劑盒。HLA-SSP分型接納neLabda公司的HLA-SSP分型試劑盒、PE9700PR儀舉行分型，接納neLabda公司提供的HLA分型格式表判讀效果。HLA-SBT分型應用ABIPRIS3100型測序儀舉行分型。DNA4l與PRixFrensi公司提供16l混淆，再參加金牌酶0.3l舉行擴增反響。PR條件如下：9510分鐘；9620秒，6030秒，723分鐘，36個循環(huán)；4frever。取PR產物5l在2%瓊脂糖凝膠中電泳，確定是否擴增。向PR產物中參加3lExSAP-IT,舉行消化反響：3720分鐘，

6、8015分鐘。消化后產物與Sequeningix混淆后，舉行測序反響：9620秒，602分鐘，共25個循環(huán)。測序反響產物用NaA/EDTA去除多余的Sequeningix，并用100%及80%EtH沉淀和純化DNA。參加15l甲酰胺，置于ABTPris3100測序儀中舉行電泳。使用athTls及TNavigatr軟件對電泳效果舉行闡發(fā)，得出HLA高區(qū)分配型效果。統(tǒng)計學闡發(fā)數(shù)據用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包處置懲罰，行hi-squaretest闡發(fā)。效果PR-SBT技能分型48例非親緣性臍血移植供受者HLA-A/B/DR接納PR-SBT技能分型全部樂成，SBT分型效果在低區(qū)分程度HLA基因型星號后

7、2位數(shù)與SSP分型效果完全同等。48例非親緣性臍血移植供受者中，HLA等位基因6/6相合4例8.3%，5/6相合37例77.1%，4/6相合7例14.6%；HLA等位基因亞型匹配5/6相合5例10.4%，4/6相合16例33.3%，3/6相合19例39.6%，2/6相合8例16.7%，未創(chuàng)造HLA等位基因亞型配型全相合病例。SBT分型效果與GVHD產生率48例非親緣性臍血移植供/受者HLA等位基因分型效果中，HLA等位基因匹配6/6、5/6和4/6位點相合的移植受者GVHD別離產生4/4例、18/37例48.6%和5/7例71.4%，統(tǒng)計闡發(fā)hi-squaretest，HLA匹配程度與GVHD

8、產生率之間無統(tǒng)計學差異P0.05。48例非親緣性臍血移植受者中，植入33例，HLA等位基因亞型匹配5/6相合的2例移植病例均未產生GVHD，而4/6、3/6、2/6位點相合的移植病例GVHD產生率別離為54.5%6/11、91.7%11/12和75.0%6/8，統(tǒng)計闡發(fā)hi-squaretest，HLA等位基因亞型不合位點不多于2個和HLA不合位點不少于3個的病例GVHD產生率具有統(tǒng)計學明顯性差異P0.05。在HLA-A等位基因亞型分型效果中，HLA-A等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2相合病例別離為11、28和9例，GVHD產生率別離為27.3%3/11、57.1%16/28和55.6%

9、5/9，統(tǒng)計闡發(fā)未創(chuàng)造HLA-A等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD產生率具有統(tǒng)計學明顯差異P=0.061表2。Table2.RelatinshipbeteenHLAisathandurrenefGVHDin48UBTreifients略在HLA-B等位基因亞型分型效果中，HLA-B等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例別離為11、33、4例，GVHD產生率別離為72.7%8/11、45.5%15/33和50%2/4，統(tǒng)計闡發(fā)未創(chuàng)造HLA-B等位基因亞型匹配完全相合與不完全相合GVHD產生率具有統(tǒng)計學明顯差異P=0.000表2。在HLA-DRB1等位基因亞型分型效果中，HL

10、A-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例別離為16、25和7個，其GVHD產生率別離為25%4/16、64.0%16/25和71.4%5/7。統(tǒng)計闡發(fā)創(chuàng)造，HLA-DRB1等位基因亞型相合與否與GVHD產生率具有強相干性P=0.003表2。在38例HLA-DRB1等位基因全相合病例中，HLA-DRB1等位基因亞型匹配0/2、1/2和2/2位點相合病例別離為16、18和4個，GVHD產生率別離為25%4/16、61.1%11/18和50%2/4；經統(tǒng)計學闡發(fā)，比力HLA-DRB1等位基因亞型相合與不相合與GVHD產生率具有明顯的統(tǒng)計學相干性P=0.008。與GVHD相干的H

11、LA等位基因亞型在本回首性研究中，HLA-A常見等位基因型為HLA-A*02、A*11和A*24，HLA-B常見等位基因型為HLA-B*15、B*40和B*46，HLA-DRB1常見等位基因型為HLA-DRB1*09、DRB1*12和DRB1*15表3。Table3.HLA-A/B/DRB1athingandurrenefGVHDbyPR-SBT略剔除兩點不合的樣本，選擇受體與供體一個位點相合而另一位點不合的病例，比力其GVHD產生率。HLA-A*02、A*11和A*24基因型別離有19例、21例和13例；HLA-B*15、B*40和B*46基因型別離有20例、13例和14例；HLA-DRB1

12、*09、DRB1*12和DRB1*15基因型別離有11例、10例和13例表3。經統(tǒng)計闡發(fā)，HLA-A*11匹配與不匹配樣本GVHD產生率別離為28.6%和64.3%，HLA-B各等位基因型匹配環(huán)境GVHD產生率未見顯著差異，HLA-DRB1*12相合3例病例均未產生GVHD，而不相合的7例病例中有2例產生了GVHD。經統(tǒng)計闡發(fā)hi-squaretestsHLA-A/B/DRB1各個等位基因匹配程度與GVHD產生率未見統(tǒng)計學相干性。討論有研究表白，單個等位基因的不匹配如碧眼兒HLA-A*0201和HLA-A*0205亞型可以引起嚴峻的GVHD；也有報道DRB1等位基因差異與GVHD之間存在強相干

13、性，并且DRB1不合與存活期收縮嚴密相干2。但是如今的研究表白，并不是全部等位基因差異與它的不相合是同等的，有些HLA等位基因的不相合是可以耐受的。在Nihlsn等3對HLA-DP抗原的報道中，接納混淆淋巴細胞造就ixedlyphyteulture,L要領不雅察到最猛烈的LR反響與DPB1*0301和DPB1*0201有關，低LR與DPB1*0401和DPB1*0402有關。進步HLA基因分型的區(qū)分率，有助于探求HLA完全相合的造血干細胞供者，也有助于針對供、受間HLA差異程度訂定相應的防治計謀。因此，有人提出界定供、受者HLA相合的尺度。尋出畢竟哪些HLA基因座位及其產物在決定異基因造血干細

14、胞移植預后中起關鍵作用，哪些HLA等位基因型別不相合為臨床所容許，乃至大概對病例的預后有益9。本研究接納HLA-SBT要領對48例非親緣性臍血移植供/受體HLA等位基因亞型舉行闡發(fā)，HLA低區(qū)分配型效果中，HLA等位基因匹配程度與GVHD產生率無明顯統(tǒng)計學相干性。對HLA-A、B、DRB1等位基因亞型別離舉行統(tǒng)計闡發(fā)創(chuàng)造，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型完全相合和不相合的病例GVHD產生率具有非常明顯的差異。必要特殊指出的是，在本研究效果中，HLA不相合等位基因亞型不多于2個和HLA不相合位點不少于3個的病例GVHD的產生率差異具有統(tǒng)計學明顯性P0.05。以上效果從兩方面給我們以提示：

15、HLA等位基因亞型程度的匹配對防范GVHD具有積極的作用；必然存在某些HLA等位基因亞型，其相合與否對臍血移植病例來說在某種程度上是可以耐受的。從效果中我們可以看到，在HLA高區(qū)分配型效果中，HLA-B和HLA-DRB1等位基因亞型匹配與否與GVHD產生率具有強相干性P=0.000，P=0.003。HLA-A等位基因亞型匹配全相合病例GVHD產生率27.3%顯著低于HLA匹配不全相合病例(59.4%)。這說明在非親緣性臍血移植中，接納高區(qū)分要領舉行HLA-B和HLA-DRB1配型可以顯著削弱GVHD的產生率。由于樣本數(shù)較少，因此對以上結論仍舊必要舉行隨訪闡發(fā)。從本效果中可以推測，HLA等位基因

16、匹配與否對非親緣性臍血移植者GVHD的產生具有緊張作用，臍血移植者GVHD的產生率低，究其緣故原由大概與臍血中免疫細胞的抗原性低有關。因此，非親緣性臍血移植時對HLA接納高區(qū)分分型是有需要的。本研究的另一個目的是試圖探求出與GVHD產生嚴密相干的HLA等位基因型，但由于病例數(shù)較少，無法對HLA全部等位基因型在非親緣性臍血移植的作用進一步深化闡發(fā)。我們選擇了HLA-A/B/DRB1位點中比力常見的亞型舉行統(tǒng)計闡發(fā)，從統(tǒng)計效果中我們未創(chuàng)造與GVHD具有顯著相干性的等位基因型。在本研究效果中，HLA-A*11等位基因相合病例的GVHD產生率25%顯著低于不相合病例的GVHD產生率58.3%，由于病例數(shù)少，無法進一步闡發(fā)HLA-A*11等位基因亞型對GVHD的影響。但我們可以假想，假設將來在移植前HLA復核時對HLA-A11接納HLA高區(qū)分要領，大概會低落移植后G