植生、生化實(shí)驗(yàn)解讀北大吳光耀

1、2011植生、生化實(shí)驗(yàn)解讀課吳光耀 教授 1.蛋白質(zhì)測(cè)定(1) 總N量測(cè)定 有機(jī)N(甘氨酸) + H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (NH4) 2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 NH4HB4O7+ HCl + 5H2O NH4Cl + 4H3BO3 用酸滴定氨1.蛋白質(zhì)測(cè)定(2) 雙縮脲法 測(cè)兩個(gè)以上的肽鍵 堿性環(huán)境雙縮脲與Cu+生成紫紅色化合物 540nm (NH2) 2CO 2 NH2-CO-NH-CO-NH2+NH31.蛋白質(zhì)測(cè)定(3) Folin-酚法 是改進(jìn)的雙縮脲法 640nm同時(shí)測(cè)定了酪氨酸酚基。1.蛋白質(zhì)測(cè)定(4)

2、紫外法 280nm 比色1.蛋白質(zhì)測(cè)定(5) 考馬斯亮藍(lán)法 考馬斯藍(lán)G-250可與蛋白結(jié)合, 從紅色染料轉(zhuǎn)變成藍(lán)色。 595nm 測(cè)定吸收值2. 核酸測(cè)定(1) RNA 測(cè)定地衣酚法 RNA + HCl 糠醛(核糖轉(zhuǎn)變) 糠醛 + 3,5-二羥基甲苯(地衣酚) 鮮綠色 670nm比色2. 核酸測(cè)定(2) DNA 測(cè)定 二苯胺法 DNA + 冰乙酸 羥酮基戊醛(脫氧核糖轉(zhuǎn)化) 羥酮基戊醛 + 二苯胺 藍(lán)色 595nm 比色2. 核酸測(cè)定(3) 定磷法 有機(jī)磷 + 高氯酸 無(wú)機(jī)磷 無(wú)機(jī)磷 + 磷鉬酸鉬藍(lán) 660nm 比色2. 核酸測(cè)定(4) 紫外法 260nm 比色3. 質(zhì)粒DNA提取和測(cè)定(1)

3、 擴(kuò)增質(zhì)粒 LB + 氨芐青霉素(2) 細(xì)菌裂解 +堿 (質(zhì)粒DNA出來(lái), 染色體DNA變性)(3) 沉淀蛋白 +乙酸鉀、酚-氯仿(4) 純化質(zhì)粒DNA 水相質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀 + RNase 溶于Tris緩沖液中(5) 260nm測(cè)定, 或電泳測(cè)定4. DNA平板電泳(1) 制膠 Tris-硼酸緩沖液(TBE) + 1%瓊脂糖(2) 加液 TBE液(3) 加樣 樣品 + 花青素(4) 電泳 濾光板看DNA移動(dòng)過(guò)程5. PCR (Polymerase chain reaction) - DNA擴(kuò)增(1) 模板、引物、dNTP、聚合酶、緩沖液、Mg+(2) 過(guò)程: 模板雙鏈分開(kāi) 結(jié)合引物 新鏈

4、合成(3) 可用毛囊DNA Y染色體DNA, 設(shè)計(jì)引物,PCR, 男有女無(wú).播放動(dòng)畫(huà)6. 層析(1) 分配層析 紙層析、液相層析(2) 吸附層析 活性碳、氧化鋁(3) 交換層析 離子交換劑(4) 凝膠層析 Sephadex Sepharose Superdex7. 糖的測(cè)定(1) 萘酚反應(yīng) 糖 + 酸 糠醛 +萘酚紫環(huán)反應(yīng)(2) 蒽酮反應(yīng) 糖 + 蒽酮+硫酸蘭綠色7. 糖的測(cè)定(3) 間苯二酚反應(yīng) 酮糖 + 酸 羥甲基糠醛 +間苯二酚 鮮紅色(4) 甲基間苯二酚反應(yīng) 戊糖 + 酸 糠醛 +地衣酚 蘭色沉淀 己糖 - 褐色沉淀8. 還原糖測(cè)定(有自由醛基)(1) 費(fèi)林反應(yīng) 葡萄糖 + Cu(OH

5、) 2+ NaOH 氧化亞酮 紅黃色9. 葉綠素性質(zhì)雙羧酸的酯 酯溶性. 非極性溶劑(正己烷、石油醚)熒光+HCl 去鎂葉綠素 +乙酸銅銅代葉綠素+NaOH 皂化10. 線(xiàn)粒體氧化磷酸化磷氧比(P/O): 這一電子傳遞鏈過(guò)程中, 形成ATP的量與消耗氧分子之間的比為磷氧比11. 希爾用離心機(jī)分離了菠菜葉綠體, 他在分離葉綠體中加入氧化態(tài)的氧化還原劑-2,6二氯靛酚(DCIP) 后照光, 發(fā)現(xiàn)DCIP被還原(氧化態(tài)蘭色, 還原態(tài)無(wú)色), 并有氧的釋放 ?；卮饐?wèn)題:(1)你認(rèn)為分離葉綠體要下述哪些條件A. 一定pH的緩沖液B. 溶液有一定的滲透勢(shì)C. 離心分離的葉綠體用水懸浮D. 離心時(shí),離心速度

6、愈高愈好E. 在攝氏4度操作和離心最好F. 在室溫操作最好回答問(wèn)題:(1)你認(rèn)為分離葉綠體要下述哪些條件A. 一定pH的緩沖液B. 溶液有一定的滲透勢(shì)C. 離心分離的葉綠體用水懸浮D. 離心時(shí),離心速度愈高愈好E. 在攝氏4度操作和離心最好F. 在室溫操作最好回答問(wèn)題:(2) 你認(rèn)為這一實(shí)驗(yàn)證明了什么?光反應(yīng)產(chǎn)生氧 B. CO2被還原C. 光反應(yīng)產(chǎn)生還原劑 D. 水被光解回答問(wèn)題:(2) 你認(rèn)為這一實(shí)驗(yàn)證明了什么?光反應(yīng)產(chǎn)生氧 B. CO2被還原C. 光反應(yīng)產(chǎn)生還原劑 D. 水被光解希爾進(jìn)一步實(shí)驗(yàn), 他將分離葉綠體懸液破碎, 離心, 分成綠色的沉淀和無(wú)色的上清液兩部分, 沉淀再用緩沖液懸浮。發(fā)

7、現(xiàn)綠色部分照光可放氧, 如將兩部分在暗處混合, 加入14CO2, 一定時(shí)間后,則14C被標(biāo)記在六碳糖上。 回答問(wèn)題: (1) 上述進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明什么?A. 光合作用可分為需光和不需光兩部分B. CO2固定是不需光的C. 氧的釋放要光D. 水的氧化要光E. 水的還原要光F. 光產(chǎn)生還原劑G. 還原劑用于CO2還原H. 光通過(guò)葉綠體起作用I. 六碳糖可氧化產(chǎn)生CO2回答問(wèn)題: (1) 上述進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明什么?A. 光合作用可分為需光和不需光兩部分B. CO2固定是不需光的C. 氧的釋放要光D. 水的氧化要光E. 水的還原要光F. 光產(chǎn)生還原劑G. 還原劑用于CO2還原H. 光通過(guò)葉綠體起作用I.

8、六碳糖可氧化產(chǎn)生CO2回答問(wèn)題:(2) 實(shí)驗(yàn)中能否用NaH14CO3代替14CO2A. 不能 B. 能回答問(wèn)題:(2) 實(shí)驗(yàn)中能否用NaH14CO3代替14CO2A. 不能 B. 能單選題1、這是Stitt研究果糖1，6-雙磷酸酯酶（F1，6Pase）被調(diào)節(jié)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中表明在磷酸二羥丙酮（DHAP）增加時(shí)，1，6一二磷酸果糖（F1，6P）和2，6一二磷酸果糖（F2，6P）對(duì)F1，6Pase的影響，你能得出如下結(jié)論：F2，6P調(diào)節(jié)F1，6Pase活性F1，6P調(diào)節(jié)F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都調(diào)節(jié)F1， 6Pase活性F1，6P和F2，6P都不調(diào)節(jié) F1，6Pase活性單選

9、題1、這是Stitt研究果糖1，6-雙磷酸酯酶（F1，6Pase）被調(diào)節(jié)的一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中表明在磷酸二羥丙酮（DHAP）增加時(shí)，1，6一二磷酸果糖（F1，6P）和2，6一二磷酸果糖（F2，6P）對(duì)F1，6Pase的影響，你能得出如下結(jié)論：F2，6P調(diào)節(jié)F1，6Pase活性F1，6P調(diào)節(jié)F1，6Pase活性F1，6P和F2，6P都調(diào)節(jié)F1， 6Pase活性F1，6P和F2，6P都不調(diào)節(jié) F1，6Pase活性單選題在研究C4植物蔗糖合成時(shí)，測(cè)得如下結(jié)果：蔗糖是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育中主要運(yùn)輸物質(zhì)，它由尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和FP首先形成磷酸蔗糖，也可由UDPG與果糖形成蔗糖。你再由光合碳代謝的知

10、識(shí)，得出如下結(jié)論：蔗糖只在葉肉細(xì)胞中合成 蔗糖只在維管束鞘細(xì)胞中合成蔗糖在兩類(lèi)細(xì)胞中都能合成 蔗糖不在兩類(lèi)細(xì)胞中合成單選題在研究C4植物蔗糖合成時(shí)，測(cè)得如下結(jié)果：蔗糖是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育中主要運(yùn)輸物質(zhì)，它由尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和FP首先形成磷酸蔗糖，也可由UDPG與果糖形成蔗糖。你再由光合碳代謝的知識(shí)，得出如下結(jié)論：蔗糖只在葉肉細(xì)胞中合成 蔗糖只在維管束鞘細(xì)胞中合成蔗糖在兩類(lèi)細(xì)胞中都能合成 蔗糖不在兩類(lèi)細(xì)胞中合成單選題3、在黑暗萌發(fā)的芥菜葉子，在萌發(fā)60小時(shí)用紅光誘導(dǎo)20分鐘，在72小時(shí)時(shí)以全黑暗為對(duì)照，進(jìn)行果糖雙磷酸酯酶（FBPase）活性測(cè)定，結(jié)果如下：pH值果糖雙磷酸酯酶活性 全黑

11、暗 光誘導(dǎo) 86 1.92 0.10 2.58 0.08 7.5 2.00 0.09 2.18 0.12在植物中有兩種FBPase，一種在葉綠體內(nèi)，一種在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)的酶在pH7.5-8.6之間有相同活性；而葉綠體內(nèi)的酶只在pH8.6有最大活性，pH7.5時(shí)幾乎無(wú)活性。你認(rèn)為光誘導(dǎo)的是哪種FBPase。葉綠體的FBPase 細(xì)胞質(zhì)的FBPase兩者都被誘導(dǎo) 兩者都沒(méi)被誘導(dǎo)單選題3、在黑暗萌發(fā)的芥菜葉子，在萌發(fā)60小時(shí)用紅光誘導(dǎo)20分鐘，在72小時(shí)時(shí)以全黑暗為對(duì)照，進(jìn)行果糖雙磷酸酯酶（FBPase）活性測(cè)定，結(jié)果如下：在植物中有兩種FBPase，一種在葉綠體內(nèi)，一種在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)的酶在pH7.5-8.6之間有相同活性；而葉綠體內(nèi)的酶只在pH8.6有最大活性，pH7.5時(shí)幾乎無(wú)活性。你認(rèn)為光誘導(dǎo)的是哪種FBPase。葉綠體的FBPase 細(xì)胞質(zhì)的FBPase兩者都被誘導(dǎo) 兩者都沒(méi)被誘導(dǎo)pH值果糖雙磷酸酯酶活性 全黑暗 光誘導(dǎo) 86 1.92 0.10 2.58 0.0