基因工程中常用的三種工具酶

1、一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)定義：凡能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定核苷酸序列的酶，也稱為限制酶(restriction enzyme, RE)。類型：來自原核生物，有三種類型。I型：兼具甲基化修飾和ATP參與的核酸內(nèi)切酶活性，隨機切割。II型：大多能特異識別46個核苷酸序列(回文結(jié)構(gòu))，最大識別序列為8個核苷酸，如 SfiI、NotI；但有近10種II型限制酶的識別序列為非回文結(jié)構(gòu)，如SfaNI、MnlI等，II型限 制酶均可作為基因工程的工具酶。另有一些來源不同的限制酶的識別位點是相同的核苷酸序 列，將這類酶特稱為同工異源酶(isoschizom

2、ers)或同裂酶。同工異源酶切割產(chǎn)生相同的末 端;有一些同工異源酶對于切割位點上的甲基化堿基的敏感性有所差別，故可用來研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI； HpaII和MspI； MboI和Sau3AI是成對的同工異源酶；其 中HpaII和MspI是一對同工異源酶，其識別位點是CCGG。與同工異源酶對應的一類限制 酶，它們雖然來源各異，識別序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱為同尾酶(isocaudamers)。常用的限制酶 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI 和 XhoII 就是一組同尾酶， 它們切割DNA之后都形成由GATC4個核苷酸組成的粘性末端。顯而易見，

3、由同尾酶所產(chǎn) 生的DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來的，因此在基因克 隆實驗中很有用處。但必須指出，由兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端，重組之后所形成的序 列結(jié)構(gòu)再不能被原來的任何一種同尾酶所識別。III型：功能基本同I型，但為特定位點切割。三種限制酶的區(qū)別如下表所示：I型II型I型DNA 底物 dsDNA dsDNA dsDNA輔助因子 Mg2+,ATP,SAM Mg2+ Mg2+,ATP識別序列特異特異特異切割位點非特定(于識別序列前后1001000bp范圍之內(nèi))特定(切割于識別序列之中或 近處，固定位點)特定(切割點在識別序列后2575bp處)與甲基化作用的關(guān)系內(nèi)切

4、酶蛋白同時具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用內(nèi)切 酶蛋白同時具有甲基化酶的作用命名：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種 名，用小寫；第四個字母代表株。另外用羅馬數(shù)字代表同一菌株中不同限制酶的編號，現(xiàn)在 常用來表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。如Hindi是來自Haemophilus influenzae D (嗜血流感桿菌D 株第三種限制酶)。切割位點和結(jié)果：限制酶位點在DNA鏈上是隨機分布的，若識別位點為4bp，則44(256) 個核苷酸可遇一個切點。若為6bp，則平均46 (4096)個核苷酸才遇到一個切點。限制酶沿 回文結(jié)構(gòu)的對稱軸切開，則產(chǎn)生平頭末端(flu

5、sh or blunt ends)如Bal I。多數(shù)限制酶錯位 切開dsDNA，產(chǎn)生5 or 3-單鏈互補順序，稱為5 or 3-粘性末端(sticky or cohesive ends),如 Hindlll、PstI。5 .反應條件：限制酶酶切反應的影響因素如下：DNA的純度 限制酶消化DNA的反應效率，在很大程度上取決于所使用的DNA本身 的純度。提取DNA時，蛋白質(zhì)、RNA、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高鹽等都有可能 抑制限制酶的活性。小量制備的DNA尤其會遇到這種問題。RNA 一般不影響酶的反應速度， 但它能和蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，從而減少酶的有效濃度。少量蛋白質(zhì)污染不影響酶活

6、性，但如果是Dnase污染則會導致DNA的降解，它可能來源于 溶解DNA的試劑溶液或者酶解緩沖液的組分。由于Dnase的活性需要有Mg2+的存在，而 在DNA的儲存緩沖液中含有二價金屬離子螯合劑EDTA，一般用1mmol/L EDTA溶液(TE) 溶解DNA，在保存DNA的過程中因為是低溫，Dnase不會有活性，一旦將DNA加入反應 體系，EDTA的濃度降低，在37C溫度下反應時，Dnase的活性就會發(fā)揮出來。混雜的結(jié)合 蛋白則與DNA結(jié)合，不僅會封閉酶的識別序列影響酶解，而且形成的DNA 一蛋白復合物 將干擾DNA的電泳行為。要避免發(fā)生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。為 了提高限

7、制酶對低純度DNA的反應效率，一般采用如下4種措施：增加限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達10單位甚至更多。增加酶反應體系的體積，以使?jié)撛诘囊种莆锉幌鄳南♂?。延長酶解反應的保溫時間。向反應體系中添加亞精胺(spermidine)(終濃度為12.5mmol/L)，亞精胺與負電性的雜 質(zhì)結(jié)合。注意，亞精胺在4C時會沉淀DNA，因此最好在反應已經(jīng)保溫數(shù)分鐘后再加入。DNA本身如果降解了，便無法挽救。但有時DNA純度很好，不存在上面所述的問題，酶 解效果不好就可能有兩種原因，一是DNA沒有溶解充分，加入反應體系的DNA比計算的 量多得多，使反應體系粘度太大，影響了酶分子的擴散或酶用量相對不足；

8、二NA用量 雖不過量但由于混合不均勻，也會影響酶解效果。識別序列的甲基化程度限制酶是原核生物限制一修飾體系的組成部分，因此，識別序 列中特定核苷酸的甲基化作用，便會強烈影響酶的活性。通常從大腸桿菌宿主細胞中分離出 的質(zhì)粒DNA，都混有dam甲基化酶及dcm甲基化酶，前者催化GATC序列中的A甲基化； 后者催化CCA/TGG序列中的C甲基化。因此，在基因克隆中要使用失去了甲基化酶的大 腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。酶切反應的溫度不同的限制酶，具有不同的最適溫度，而且彼此之間有相當大的變動 范圍。大多數(shù)限制酶的最適溫度在37C，但有許多例外的情況，如Sma I是25C； Mae I 45C、BclI5

9、0C、Maem55C、BstII60C、Taq I 65C等等。（4）DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同構(gòu)型對限制酶的活性也有很大影響。某些限制酶切 割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA高出許多倍，最高可 達20倍。還有一些限制酶切割不同部位的酶切位點，其效率有明顯的差別。（5）酶解緩沖液各組分的影響使用不適宜的酶解緩沖液，常是導致酶解效果不好的原因。 緩沖液要新鮮配制，各種離子及其濃度要準確，pH要調(diào)準。在反應條件不恰當時，某些限 制酶會出現(xiàn)“星號”活性，即它們不再嚴格遵循從識別序列酶解DNA，而會在其他的序列 切斷DNA,如 EcoR I，其“星號”活性表現(xiàn)在它自

10、AATT序列處切斷DNA。Tris-HCl緩沖液是比較理想的限制酶反應緩沖體系，在pH7.48.0有較大的緩沖容量。Mg2+是酶的激活劑，終濃度一般需在5mmol/L以上，如果反應體系中存在螯合劑（如EDTA 和枸櫞酸），游離Mg2+的濃度會減少，使酶活性下降。當Mg2+被其他二價金屬離子（如 Mn2+、Co2+或Zn2+）取代時，不僅會影響酶的活性還會改變酶的識別特異性。反應體系中的NaCl僅提供一定的離子強度。不同的酶要求不同的NaCl濃度。個別的酶需 要其他的離子，如Sma I絕對需要K+，Pst I更易被NH+4激活。大部分緩沖體系中含二巰基乙醇（BSH，110mmol/L）或二硫蘇糖

11、醇（DTT，1mmol/L）。加入巰基化合物的目的是為了去除一些能與巰基去反應的化合物對酶的抑制。但不是所有的 酶都需要添加巰基化合物，如EcoRl、Hindlll等；而BamHl、Aval、PvuII和Sma I非 要巰基化合物不可。不需要者可省去，需要者則應新鮮配制。反應體系中的牛血清白蛋白（BSA）或白明膠是用來穩(wěn)定酶活性的。當反應體系中蛋白濃度 低于20ug/p l時，有些酶就會極不穩(wěn)定。加入BSA后，不僅可減少蛋白的降解，而且還能 減輕非特異吸附造成的酶蛋白丟失。但所用的BSA純度較高，不含Dnase。用白明膠可代 替BSA。但過量的BSA也會與DNA結(jié)合而影響DNA的電泳分離。水的

12、質(zhì)量不容忽視，所用的水應該是無離子及有機化合物的玻璃器皿重蒸水，去離子水也能 滿足要求。（6）酶活性限制酶的單位：在限定條件下，1小時消化川g DNA所需的酶量為1單位。 這是最為重要的。比活較低的酶，因加入的酶溶液體積大，常有甘油濃度太高的問題，為了 避免甘油濃度高于5%，反應體系體積較大，對下步的電泳操作帶來不便。此外，某些酶由 于保存時間長，活性降低（以至失活），或者反復取用受到污染或暴露于室溫時間太久，也 會導致酶活性降低。因此在進行重要樣品酶解前最好測定酶活性的強弱，以免損失樣品。二、T4 DNA 連接酶（T4 DNA ligase）從T4噬菌體感染的大腸桿菌中分離的。能催化兩個DNA片段的3 -OH和5 -磷酸形成 3，5 -磷酸二酯鍵，將兩個片段連接成為一個共價結(jié)合的DNA分子。三、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱依賴RNA的DNA聚合酶(RNA dependent DNA polymerase, RDDP)。屬于多功能性 酶。RDDP：以mRNA為模板，以帶3 -OH的DNA片段為引物合成cDNA。外切RNA酶活性：底物是RNA-DNA雜化分子中的RNA鏈。從RNA鏈5 -端外切者 稱為