臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)熒光免疫技術(shù)講義

1、第八章熒光免疫技術(shù)第一節(jié)概述熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。一、熒光的基本知識(shí).熒光：熒光就是某些物質(zhì)受到一定波長(zhǎng)光的激發(fā)后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出的波長(zhǎng)大于激發(fā)光波長(zhǎng)的 光。.發(fā)射光譜：發(fā)射光譜是指固定激發(fā)光波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下所記錄到的樣品所發(fā)射的熒光強(qiáng)度譜圖。 激發(fā)態(tài)電子回到的能級(jí)不同，發(fā)出的熒光波長(zhǎng)就不同。熒光物質(zhì)在吸收光能后，即刻發(fā)射熒光，一旦停止 供能，熒光隨即消失。.激發(fā)光譜：激發(fā)光譜是指固定檢測(cè)發(fā)射光熒光波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光照射樣品所記錄到的相應(yīng) 的熒光發(fā)射強(qiáng)度譜圖。.熒光效率；在一定范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)，即激發(fā)光越強(qiáng)，熒光越強(qiáng)，但過(guò)強(qiáng)的 激發(fā)光會(huì)使熒

2、光很快褪去。.熒光壽命：熒光物質(zhì)被激發(fā)后產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間稱為熒光壽命。.熒光淬滅：熒光物質(zhì)在某些理化因素（如紫外線照射、高溫、苯胺、酚、硝基苯等）作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。.熒光偏振。二、熒光物質(zhì)（一）熒光色素.異硫氟酸熒光素（FITC）:為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或乙醇等溶劑。分子量為389.4kD,最大吸收光波長(zhǎng)為 490495nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 520530nm,呈現(xiàn)明亮的 黃綠色熒光。其主要優(yōu)點(diǎn)是： 人眼對(duì)黃綠色較為敏感；通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色熒光。.四乙基羅丹明（RB20。：不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。最大

3、吸收光波長(zhǎng) 為570nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 595600nm,呈橘紅色熒光。.四甲基異硫鼠酸羅丹明（TRITC）:最大吸引光波長(zhǎng)為 550nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 620nm,呈橙紅色 火光。.藻紅蛋白（R-R日：最大吸引光波長(zhǎng)為 565nm最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 578nm,呈明亮的橙色熒光。（二）其他熒光物質(zhì).例系螯合物：其中以 旦3+應(yīng)用最廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄，熒光衰變 時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。.酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)：4-甲基傘酮-3 -D半乳糖昔本身無(wú)熒光，受3-半乳糖昔酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光。其他如堿性磷酸酶的底物是4-

4、甲基傘酮磷酸鹽，辣根過(guò)氧化物酶的底物是對(duì)羥基苯乙酸等。第二節(jié)熒光抗體技術(shù)熒光抗體技術(shù)是以 熒光素標(biāo)記抗體，與切片中組織或細(xì)胞抗原反應(yīng)，經(jīng)洗滌分離后，在熒光顯微鏡下 觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，借此對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè),或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定，此技術(shù)亦稱熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)。、熒光抗體的制備（一）抗體要求將熒光素與特異性抗體以化學(xué)共價(jià)鍵的方式結(jié)合而成。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。（二）熒光素要求異硫氟酸熒光素最常用一要求：應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成 共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán),與蛋白質(zhì)結(jié)合后 不易解離，而未結(jié)合的色素及其降 解產(chǎn)物易于清除；熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后

5、，仍能保持較高的熒光效率；熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明；與蛋白質(zhì)結(jié)合后 不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì);標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒；與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。（三）抗體的熒光素標(biāo)記.攪拌標(biāo)記法：以FITC標(biāo)記為例。先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/L pH9.0 的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌 46小時(shí)后，離心，上清液即為標(biāo)志物。此法適用于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短、熒光素用量少。但本法的影響因素多， 若操作不當(dāng)會(huì)引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。.透析法：適用于標(biāo)記樣品量少、蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻，非特

6、異染色也較低。方法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含 FITC的0.01mol/L pH9.4 的碳酸鹽緩沖液中反應(yīng) 過(guò)夜，以后再對(duì) PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清液。（四）熒光素標(biāo)記抗體的純化抗體標(biāo)記完成后，還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體作進(jìn)一步純化，以去除未結(jié)合的游離的熒光素。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。（五）熒光抗體的鑒定.熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率熒光素與蛋白的 過(guò)量結(jié)合是非特異熒光著色的來(lái)源之一，而未結(jié)合者有抑制特異性熒光抗體反應(yīng)的作用。熒光素結(jié)合到蛋白上的量的重要指標(biāo)是熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率（F/P）。熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率（F/P）是指熒光素（F）結(jié)合到抗體蛋白（

7、P）上的量。F/P比值越大，表明抗體分子結(jié)合的熒光素越多，反之則結(jié)合越少。一般用于組織切片的熒光抗體,其F/P=1.5為宜,用于 活細(xì)胞染色 以F/P = 2.4為宜。.抗體效價(jià) 可以采用 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定，抗原含量為1g/L時(shí),抗體效價(jià) 1:16者較為理想。.抗體特異性 吸收試驗(yàn)：向熒光抗體中加入 過(guò)量相應(yīng)抗原 反應(yīng)后,再用于陽(yáng)性標(biāo)本 染色,應(yīng)不出現(xiàn) 明顯熒光； 抑制試驗(yàn)：陽(yáng)性標(biāo)本 先與相應(yīng)未標(biāo)記抗體反應(yīng) ，洗滌后，再加熒光抗體 染色,熒光強(qiáng)度應(yīng)受 到明顯抑制。（六）熒光抗體的保存防止抗體失活和防止熒光淬滅。最好小量分裝，-20 C凍存可保存23年。真空干燥后可長(zhǎng)期保存。稀釋后的抗體不宜

8、長(zhǎng)時(shí)間保存，在4c可保存13天。二、標(biāo)本的制作組織材料可制備成石蠟切片（較少用）或冷凍切片，切片要求盡量薄些，以利于抗原抗體接觸和鏡檢。組織標(biāo)本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上12層組織細(xì)胞。細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。過(guò)程中應(yīng)保持抗原的完整性，并在操作中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中去。、熒光抗體染色與結(jié)果判斷熒光抗體與抗原反應(yīng)，一般在2537C, 30分鐘,不耐熱抗原的檢測(cè)則以 4 c過(guò)夜為宜。（一）直接法：用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上。本法操作簡(jiǎn)便，特異性高，非特異熒光染色因素 少；缺點(diǎn)是敏感度偏低，需制備特異性的熒光抗體。（二）間接

9、法：可用于檢測(cè)抗原和抗體，普通一抗+熒光二抗。靈敏度高，僅需一種熒光抗體。（三）雙標(biāo)記法：FITC及羅丹明分別標(biāo)記不同的抗體，而對(duì)同一標(biāo)本作熒光染色。（四）熒光抗體染色結(jié)果判斷：在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)均需設(shè)立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)對(duì)照（陽(yáng)性和陰性對(duì)照）。陽(yáng)性細(xì)胞的顯色分布有胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型三種類(lèi)型 。臨床上根據(jù)特異性熒光強(qiáng)度達(dá)“+”以上判定為陽(yáng)性?！?”為無(wú)或僅見(jiàn)極微弱熒光；“+”為熒光較弱但清楚可見(jiàn)；“+”為熒光明亮；“+”為耀眼的強(qiáng)熒光。四、熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)免疫熒光顯微技術(shù)的基本原理是熒光抗體與待測(cè)標(biāo)本中的組織或細(xì)胞抗原結(jié)合后，在熒光顯微鏡下觀 察，在黑色背景上可見(jiàn)明亮的特異性熒光即可對(duì)標(biāo)本中的抗原

10、物質(zhì)進(jìn)行鑒定。（一）光源 由于熒光物質(zhì)的量子效率極低，要有一個(gè)很強(qiáng)的激發(fā)光源，通常用高壓汞燈、氤燈或鹵素 燈作為激發(fā)光源。（二）濾光片 濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重要條件。濾光片分為隔熱濾光片、激發(fā) 濾光片和吸收濾光片。.隔熱濾光片位于燈室的聚光鏡前面，能阻斷紅外線的通過(guò)而隔熱。.激發(fā)濾光片位于光源和物鏡之間，能選擇性地透過(guò)紫外線可見(jiàn)波長(zhǎng)的光域，以提供合適的激發(fā)光。.吸收濾光片 位于物鏡和目鏡之間，作用是阻斷激發(fā)光而使發(fā)射的熒光透過(guò)，使標(biāo)本在暗的背景上呈 現(xiàn)熒光易于觀察，也使眼睛免受強(qiáng)激發(fā)光刺激。（三）光路分為透射光和落射光兩種形式。（四）聚光器 聚光器有明視野、暗視野和相差熒光

11、聚光器等。（五）鏡頭 目鏡有氟處理、消色差和復(fù)消色差三類(lèi)鏡頭，常用的是消色差鏡頭。 第三節(jié)熒光免疫分析的類(lèi)型熒光免疫測(cè)定是將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物中特 異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）用弱系元素標(biāo)記抗原或抗體，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨。（一）基本原理.時(shí)間分辨：正常組織在激發(fā)光照射下可以發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光,干擾檢測(cè)結(jié)果。但該熒光壽命較短（110ns）,而例系元素螯合物的熒光壽命較長(zhǎng)（101000 ps）。故待短壽命背景熒光完全衰變后再測(cè)定翎系元素離子

12、螯合物的特異性熒光信號(hào)。. Stokes位移:選擇熒光物質(zhì)作為標(biāo)志物時(shí)，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長(zhǎng)差 ，即Stokes位移。.發(fā)射光譜和激發(fā)光譜：例系元素發(fā)射光譜帶較窄，多在613nm土 10nmi利用濾光片只允許此波段的熒光通過(guò)，避免干擾。.熒光標(biāo)記物的相對(duì)比活性：比活性是指單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)標(biāo)記分子可被探測(cè)到的信號(hào)量。.信號(hào)增強(qiáng)：Eu3+標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物在弱堿性溶液中被激發(fā)后的熒光信號(hào)較弱，加入一種酸性增強(qiáng)液可使Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來(lái)，并與另一種螯合劑所螯合，以增強(qiáng)熒光信號(hào)。（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法.標(biāo)記物：用于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定的標(biāo)志物是例系元素，包括鋪（Eu）、彭（Sn3+

13、）、鉞（Tb3+）、鉉（NcT）和鎬（Dys+）等，它們的熒光壽命較長(zhǎng)，尤其是 Eu和Tb3+的熒光壽命特別長(zhǎng)且熒光強(qiáng)。多用 Eu3 +和Tb3+為標(biāo)記物，其中 Eu=最為常用。.標(biāo)記方法：例系元素離子不能直接與抗原或抗體結(jié)合，需應(yīng)用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑，其一端與翎系元素離子結(jié)合，另一端與抗原或抗體蛋白分子上的氨基結(jié)合，形成翎系元素離子-螯合劑-抗原（或抗體）復(fù)合物。（三）方法類(lèi)型.雙抗夾心法.固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法：待檢抗原和Eu3+標(biāo)記的抗原 與固相抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法：待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與待檢抗

14、原含量成反比。（四）方法評(píng)價(jià).優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；分析范圍寬；標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，有效使用期長(zhǎng)；測(cè)量快速，易自動(dòng)化；無(wú)放射性 污染。.缺點(diǎn)：易受環(huán)境、試劑和容器中的翎系元素離子的污染，使本底增高。二、熒光偏振免疫測(cè)定利用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物的熒光偏振程度的差異，測(cè)定體液中小分子物質(zhì) 的含量。（一）基本原理當(dāng)光線通過(guò)偏振濾光片后，形成只有一個(gè)方向的平面光，稱之為偏振光。熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的偏振 光（藍(lán)光，485nm）激發(fā)后，可吸收光能并發(fā)射出相應(yīng)的偏振熒光（綠光，525550nm）,偏振熒光有很強(qiáng)的方向性。熒光偏振免疫測(cè)定常用異硫氟酸熒光素 （FITC）標(biāo)記小分子抗

15、原。（二）方法評(píng)價(jià)熒光偏振免疫測(cè)定樣品用量少；熒光素標(biāo)記結(jié)合物穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)；方法重復(fù)性好；快速，易自動(dòng) 化；試劑盒專屬性強(qiáng),適于檢測(cè)小分子和中等分子物質(zhì)，不適宜測(cè)定大分子物質(zhì)；靈敏度較非均相熒光免疫測(cè)定法低。三、熒光酶免疫測(cè)定利用酶標(biāo)抗體（抗原）與待檢抗原（抗體）反應(yīng)，借助酶反應(yīng)熒光底物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定且高效 的熒光物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量。（一）基本原理：以堿性磷酸酶（ALP）標(biāo)記抗體（或抗原），以固相載體包被抗原（或抗體），堿性磷酸酶分解熒光底物 4-甲基傘酮磷酸鹽（4-MUP）形成4-MU,經(jīng)360nm激發(fā)光的照射，發(fā)出 450nm的熒光。（二）方法類(lèi)型.雙

16、抗夾心法：固相抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記抗體與待檢抗原反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入底物4-MUP熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成 正比。.雙抗原夾心法：用固相抗原和酶標(biāo)記抗原與待檢抗體反應(yīng)，生成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合部分，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光，熒光強(qiáng)度與待檢抗體含量成正比。.固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法： 待檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合定量的酶標(biāo)抗體，洗滌除去未結(jié)合部分，固相抗原與酶標(biāo)抗體形成的復(fù)合物被留下來(lái)，加入底物進(jìn)行酶促發(fā)光反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。（三）方法評(píng)價(jià)由于使用酶和熒光底物的化學(xué)反應(yīng)作為放大系統(tǒng)，故靈敏度大大提高。但血清和其他生物樣品的背景 熒光會(huì)干擾測(cè)

17、定，因此用固相熒光酶免疫測(cè)定法效果好。第四節(jié)熒光免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用一、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用.自身抗體檢測(cè) 檢測(cè)血清抗核抗體、抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體等自身抗體，輔助診斷自身免疫性 疾病。.病原體檢測(cè) 熒光抗體技術(shù)可快速鑒定病原體并可檢測(cè)血清中抗體,用于疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和 臨床回顧診斷。.免疫病理檢測(cè) 可用于組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體和抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)及腫瘤組織中腫瘤特異性抗原的鑒定。.細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)可用于淋巴細(xì)胞表面 CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測(cè)以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。.流式細(xì)胞分析 將游離細(xì)胞作熒光抗體染色后，經(jīng)單色激光照射后發(fā)出的熒光信號(hào)由

18、熒光檢測(cè)計(jì)檢 測(cè)。二、熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用.時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定：用于蛋白質(zhì)、激素（肽類(lèi)激素、甲狀腺激素、類(lèi)固醇激素等）、藥物、腫 瘤標(biāo)志物、病原體抗原/抗體等測(cè)定。.熒光偏振免疫測(cè)定：適用于血清或尿液中小分子物質(zhì)的測(cè)定，如藥物、維生素、激素。.熒光酶免疫測(cè)定：可用于多種抗原抗體的檢測(cè)，如病毒抗體、細(xì)菌及毒素抗原、激素、腫瘤標(biāo)志物、 過(guò)敏原、心肌損傷標(biāo)志物和凝血因子等。【習(xí)題】臨床中最常用的熒光色素是A.異硫氟酸熒光素B.四乙基羅丹明C.四甲基異硫鼠酸羅丹明D.例系螯合物E.藻紅蛋白正確答案 A答案解析臨床中最常用的熒光色素是異硫氟酸熒光素。最早被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是A.酶B.放射性核素

19、.火光系D.金顆粒E.化學(xué)發(fā)光劑正確答案C答案解析最早被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中標(biāo)記物的是熒光素。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體的熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（F/P）值應(yīng)為A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4F/P= 1.5為宜，用于活細(xì)胞染色以F/ P= 2.4為宜。正確答案C答案解析一般用于組織切片的熒光抗體，其用于活細(xì)胞染色的熒光抗體的熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（F/P）值應(yīng)為A.0.5B.1.0C.1.5D.2.0E.2.4正確答案E答案解析一般用于組織切片的熒光抗體，其F/P= 1.5為宜，用于活細(xì)胞染色以F/ P= 2.4為宜。在熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)中，熒光素與抗體之間的結(jié)合靠的是A.范

20、德華力B.氫鍵C.離子鍵D.共價(jià)鍵E.靜電引力正確答案D答案解析在熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)中，熒光素與抗體之間的結(jié)合靠的是共價(jià)鍵。熒光抗體技術(shù)中，臨床上常用的只需一種標(biāo)記抗體即可檢測(cè)多種抗原的方法是A.直接法B.間接法C.補(bǔ)體結(jié)合法D.雙標(biāo)記法E.熒光偏振免疫法正確答案B答案解析間接法 可用于檢測(cè)抗原和抗體。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對(duì)抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體）為針對(duì)第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。用間接法免疫熒光技術(shù)檢測(cè)組織中的抗原，應(yīng)將熒光素標(biāo)記A.抗原B.相應(yīng)抗體C.抗免疫球蛋白抗體D.抗原-抗體復(fù)合物E.抗C3抗體正確答案C答案解析用間接法免疫熒光技術(shù)檢測(cè)組織中的抗原，應(yīng)將熒光素標(biāo)記抗免疫球蛋白抗體。目前臨床上細(xì)菌菌種鑒定應(yīng)用較多的方法是A.ELISAB.放射免疫技術(shù)C.化學(xué)發(fā)光法D.熒光抗體技術(shù)E.金免疫技術(shù)正確答案D答案解析目前臨床上