基于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥中的應(yīng)用展望

1、基于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的檢測研究及其在堆肥中的應(yīng)用展望【摘要】金納米顆粒作為一種性能優(yōu)異的標(biāo)記物應(yīng)用廣泛。隨后開展出來的免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)作為一種靈敏度高、操作步驟簡便、檢測快速的免疫反響檢測技術(shù)得到廣泛關(guān)注。本文介紹了免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的根本原理、制備方法并詳述了近年來該技術(shù)的新開展。此外，結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫檢測與環(huán)境檢測實(shí)際工作中的應(yīng)用，展望了其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用潛力和開展前景。【關(guān)鍵詞】膠體金；標(biāo)記；免疫檢測；堆肥;評述abstratldnanpartilehasbeenidelyusedasagdlabelingsubstane.subsequently,inreasin

2、gnernhasbeenpaidtiungldlabelingtehniquehihhashighsensitivity,siplepredureandrapiddetetininiunassay.hebasipriniple,preparatinethdsandiprtantdevelpentsfiungldlabelingtehniqueereintrduedinthisartile.inadditin,theneappliatinsandprspetsfiungldlabelingtehniqueinpstdetetinereprpsedbasedntheappliatinsiniuna

3、ssayandenvirnentalanalysis.keyrdsllidalgld;labeling;iunassay;psting;revie1引言堆肥被認(rèn)為是將固體廢物減量化、資源化的最正確途徑1。研究建立有效而實(shí)用的原位、在體、實(shí)時(shí)、高靈敏度、高選擇性的分析檢測方法，用于檢測與控制堆肥過程中生物組分及污染物，這是堆肥研究中的關(guān)鍵技術(shù)。傳統(tǒng)的堆肥分析檢測方法常需要繁雜、冗長的萃娶提純、濃縮、色譜別離等步驟，而且試劑用量大，費(fèi)用高2。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金為示蹤標(biāo)記物，應(yīng)用于特異性抗原抗體反響的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金具有納米材料所特有的三大效應(yīng)：外表效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧

4、道效應(yīng)，具有很大的比外表積，獨(dú)特的光學(xué)、導(dǎo)電、導(dǎo)熱等物理特性以及良好的生物相容性35，可以與蛋白質(zhì)、核酸等非共價(jià)結(jié)合，且檢測不依賴昂貴的激光檢測儀器，只需普通光學(xué)儀器，甚至肉眼可辨。另外免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)具有制作方便、價(jià)格低廉、容易操作、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)，滿足了現(xiàn)場快速環(huán)境檢測及實(shí)時(shí)監(jiān)測等方面的要求。但是該技術(shù)在環(huán)境污染治理領(lǐng)域，特別是堆肥環(huán)境檢測的應(yīng)用起步較晚，相關(guān)報(bào)道較少。本文通過評述免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)近年來的新開展及實(shí)際應(yīng)用情況，特別是在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展來展望其在堆肥環(huán)境檢測中的應(yīng)用前景。2免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的研究現(xiàn)狀2.1膠體金標(biāo)記原理與制備膠體金是氯金酸在復(fù)原劑的作用下，聚合成特

5、定大小的金顆粒，并由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱之為膠體金6。在堿性條件下，膠體金顆粒外表帶負(fù)電荷，可與目的蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間形成非共價(jià)鍵的靜電吸引而結(jié)實(shí)結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。吸附在膠體金外表的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運(yùn)到組織或細(xì)胞內(nèi)、固相載體上的相應(yīng)抗體、抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標(biāo)記物在抗原抗體反響處聚集到達(dá)一定密度時(shí)即金顆粒107個(gè)/2，出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點(diǎn)7。膠體金標(biāo)記物又被稱為膠體金結(jié)合物、膠體金探針或免疫金。被標(biāo)記物須經(jīng)過徹底除鹽的預(yù)處理，而制備穩(wěn)定的膠體金結(jié)合物受多種因素影響，如金顆粒大孝離子濃度、被標(biāo)記物用

6、量及標(biāo)記體系的ph值等。最適ph值一般接近或略大于被標(biāo)記物的等電點(diǎn)，而被標(biāo)記物的用量取決于金顆粒的大校2.2免疫金標(biāo)記技術(shù)的開展1971年,faulk等11把免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)用于細(xì)胞構(gòu)造的透射電鏡te研究后，關(guān)于膠體金制備和應(yīng)用研究的報(bào)道逐漸增多。1983年，hlgate等12將免疫金染色技術(shù)igs與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀染色法iungldsilverstaining,igss，利用膠體金催化溶液中銀離子的復(fù)原，使金屬銀在膠體金外表聚集，而聚集的銀又起到了催化的作用，使得更多的銀被復(fù)原如圖1。通過這種增強(qiáng)作用使得在光鏡下可視粒子的半徑比單獨(dú)的金顆粒增加了1050倍，這樣可以采用小顆粒

7、15n以增加標(biāo)記密度，從而有效地進(jìn)步了免疫膠體金標(biāo)記的靈敏度?？乖璦ntigen;銀顆粒silvernanpartile;金顆粒gldnanpartile;抗體antibdy.近年來，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)得到了不斷地開展和改良，微波技術(shù)開場應(yīng)用其中。galvez等13在不改變其它實(shí)驗(yàn)條件的情況下采用微波技術(shù)進(jìn)展標(biāo)記，使標(biāo)記過程中固定時(shí)間至少縮短20in。兩種技術(shù)的結(jié)合使標(biāo)記效果更好，背景明晰，而且縮短染色時(shí)間。同時(shí)增加反響強(qiáng)度后較常規(guī)方法所需抗體濃度低，可節(jié)約價(jià)格昂貴的一抗。免疫層析法iunhratgraphy是20世紀(jì)90年代興起的一種快速診斷技術(shù)，膠體金免疫層析技術(shù)gia就是利用膠體金本身的

8、顯色特點(diǎn)結(jié)合免疫層析技術(shù)診斷特異性的待測物而開展起來的。這項(xiàng)技術(shù)既可采用雙抗體夾心法測抗原，又可用間接法、競爭法測抗體。在該技術(shù)根底上研制的膠體金免疫層析試紙條、試劑盒操作起來方便快捷，應(yīng)用前景廣闊。3免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展早期免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用于光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞外表抗原進(jìn)展組化研究，但因靈敏度低而受到限制。igss創(chuàng)立以后免疫金標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。目前，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在組化中的應(yīng)用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下明晰可辨，因此該技術(shù)進(jìn)一步在電鏡上使用，由對組織細(xì)胞定位研究，進(jìn)一步深化到了基因轉(zhuǎn)錄程度、基因表達(dá)的檢測、染色體的基

9、因定位、特定核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的空間分布分析及核酸復(fù)制過程中的定性與定量分析等。3.1免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫檢測中的應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的逐步開展使其在免疫檢測等許多領(lǐng)域已得到越來越多的應(yīng)用。in等21分別制備核定位信號nls1及nls2抗體，電鏡檢測兩種金標(biāo)抗體在a流感病毒vrnp構(gòu)造中的位點(diǎn)，以理解二者運(yùn)輸vrnp中的不同作用。檢測結(jié)果顯示:71%的vrnps上檢測到nls1抗體，低于10%vrnps上檢測到nls2抗體。jiang等22結(jié)合微陣列技術(shù)與免疫金標(biāo)記技術(shù)檢測弓形蟲感染、風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒、泡疹trh對妊娠期婦女及胎兒危害極大的病毒ig抗體，檢出限達(dá)0.24g/l，操作方便。在

10、腫瘤診斷方面應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)結(jié)合生物體視學(xué)和圖像分析技術(shù)，討論良惡性腫瘤和癌前病變病理形態(tài)的定量診斷方法，使診斷的正確率明顯進(jìn)步。由于膠體金具有肉眼可觀測的紅色，所以既可用于免疫電鏡、光鏡檢測，又能作為指示物結(jié)合固相載體用于體外免疫檢測抗原或抗體的存在。在檢測病原微生物方面，kalvathev23最早利用膠體金標(biāo)記的抗立克次體的多克隆抗體、單克隆抗體及igy來檢測標(biāo)本中的斑點(diǎn)熱群立克次體。zhu等24用膠體金標(biāo)記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(prrsv)蛋白及蛋白n單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上與二抗構(gòu)造夾心構(gòu)造檢測prrsv，檢出限可達(dá)7.81031.6104tid50/l。3.2免疫膠體金

11、標(biāo)記技術(shù)在環(huán)境檢測中的應(yīng)用由于免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)不斷地開展改良及其各種技術(shù)優(yōu)勢，已不僅僅局限應(yīng)用在單一領(lǐng)域。近年來在環(huán)境學(xué)科中的報(bào)道逐漸增多，主要表達(dá)在兩方面：一是利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電鏡等檢測技術(shù)，通過觀察所測物質(zhì)的微觀構(gòu)造形態(tài)、空間位點(diǎn)變化來提醒其作用機(jī)理或者檢測宏觀性能指標(biāo)；二是利用免疫層析技術(shù)制備免疫膠體金試紙條或試劑盒，現(xiàn)場快速檢測進(jìn)展定性、定量分析。水體環(huán)境質(zhì)量對人類生活有直接影響，操作簡便、檢測快速、靈敏度高及選擇性好的水質(zhì)檢測方法能極大進(jìn)步檢測效率。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)便被逐漸應(yīng)用在水質(zhì)檢測及有關(guān)污染物分析研究中。吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，長期將未代謝完的非甾體抗炎藥排入

12、水體，將會(huì)對水生生物造成危害34。li等35制備的快速免疫層析金標(biāo)試紙條，在10in內(nèi)檢測水樣中吲哚美辛的檢出限達(dá)0.1ng/l，且在室溫下可存放8星期，適應(yīng)于現(xiàn)場快速檢測。小球隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲會(huì)引起人類腸胃疾病，是水質(zhì)檢測的指標(biāo)。rule等36結(jié)合外表增強(qiáng)共振拉曼散射serrs與免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)檢測這兩種病原體，證明了兩種技術(shù)的結(jié)合進(jìn)展高靈敏度、多種物質(zhì)同時(shí)檢測的可行性。短裸甲藻毒素是一種與赤潮有關(guān)的神經(jīng)毒素。zhu等37利用膠體金標(biāo)記的單克隆短裸甲藻毒素抗體制備了快速免疫層析試紙條，在10in的現(xiàn)場檢測時(shí)間內(nèi)檢出限為20g/l。檢測樣中短裸甲藻毒素濃度在104000g/l的范圍內(nèi)，試

13、紙條檢測區(qū)的顏色強(qiáng)度與短裸甲藻毒素濃度呈正相關(guān)。微囊藻毒素是由藍(lán)藻產(chǎn)生的一種七肽單環(huán)肝毒素，它通過食物鏈傳遞嚴(yán)重威脅人類安康。yung等38將選取的一株藍(lán)藻用一系列梯度乙醇脫水處理后，用低溫切片機(jī)切片進(jìn)展金標(biāo)記后，利用透射電鏡檢測微囊藻毒素在藍(lán)藻細(xì)胞中的位點(diǎn)以獲取微囊藻毒素如何產(chǎn)生、作用機(jī)理及衰亡等信息。結(jié)果顯示微囊藻毒素分布在類囊體、細(xì)胞原生質(zhì)、多磷體邊緣及羧化體中，在細(xì)胞壁及多磷體內(nèi)局部布較少。gerbersdrf39利用純化的高特異性微囊藻毒素抗體對微囊藻毒素進(jìn)展免疫膠體金標(biāo)記定位，檢測在不同光強(qiáng)度、光密度、光譜范圍下生長的藍(lán)藻細(xì)胞中微囊藻毒素的密度，發(fā)現(xiàn)光合有效輻射對微囊藻毒素的生物合

14、成影響很大。木質(zhì)素是農(nóng)作物秸桿及城市生活垃圾中一種常見的、難降解的物質(zhì)，處理不當(dāng)會(huì)造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，木質(zhì)素的研究逐漸引起人們的關(guān)注40。he等41利用紫外光顯微鏡、透射電鏡結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記，檢測了杜仲次生木質(zhì)局部化過程中木質(zhì)素等組分在細(xì)胞壁分布的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示隨著細(xì)胞次生壁的形成與木質(zhì)化，木質(zhì)素的分布逐漸擴(kuò)展，其沉積出現(xiàn)不均勻的塊狀或片狀沉積形式。jseleau等42生物合成純化的紫丁香基脫氫多聚體以制備紫丁香基木質(zhì)素多克隆抗體，并利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對植物細(xì)胞中紫丁香基木質(zhì)素進(jìn)展定位檢測，發(fā)現(xiàn)其在s1層中分布較少，而在次生細(xì)胞壁形成后期分布較多。該小組還分別標(biāo)記木質(zhì)

15、素抗體和紫丁香基木質(zhì)素抗體來檢測應(yīng)拉木中木質(zhì)素含量和構(gòu)造組成的關(guān)系，認(rèn)為應(yīng)拉木凝膠層中木質(zhì)素含量較少，但紫丁香基木質(zhì)素構(gòu)造含量較高43。研究說明，白腐真菌是降解木質(zhì)素一類芳香化合物才能最強(qiáng)的微生物44。白腐真菌通過自身分泌的酶液的共同作用可迅速、有效地降解木質(zhì)素45。因此木質(zhì)素降解酶成為研究熱點(diǎn)，期望由此可理解微生物降解木質(zhì)素的機(jī)制。daniel等46將電鏡技術(shù)與免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，檢測白腐菌降解木質(zhì)素過程中分泌的關(guān)鍵酶液的空間分布及木質(zhì)素的形態(tài)變化情況，結(jié)果顯示酶分布與細(xì)胞壁構(gòu)造的形態(tài)改變有關(guān)，檢測發(fā)現(xiàn)胞外粘液為酶液進(jìn)入細(xì)胞壁降解區(qū)域起了重要作用。4展望隨著城市化進(jìn)程的加快，有機(jī)固體廢

16、物數(shù)量急劇上升。堆肥化是符合可持續(xù)開展的有機(jī)固體廢物處理方法，具有強(qiáng)大的生命力。免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)以其制備簡單、適用范圍廣、平安等優(yōu)勢趨于商業(yè)化應(yīng)用，在免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域有著普遍應(yīng)用，但該技術(shù)應(yīng)用于堆肥環(huán)境研究的報(bào)道較少，特別是應(yīng)用于堆肥環(huán)境檢測的研究。堆肥化是微生物降解有機(jī)固體廢物的過程，加強(qiáng)堆肥過程中微生物對有機(jī)固體廢物的酶解作用便成為堆肥快速腐熟的關(guān)鍵。而堆肥過程中微生物所產(chǎn)生的生物酶蛋白的研究還不完善，結(jié)合經(jīng)濟(jì)可行性考慮，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在堆肥檢測中的應(yīng)用可以從以下幾個(gè)方面開展研究：1溫度、ph值等環(huán)境因素會(huì)影響酶促反響的效果，利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對不同環(huán)境因素下酶蛋白進(jìn)

17、展定位、定量檢測確定酶蛋白在堆肥基質(zhì)中的最正確作用條件；2微生物降解有機(jī)固體廢物過程中分泌的酶液并不是單一的，采取雙重或多重免疫膠體金標(biāo)記檢測不同酶蛋白在堆肥過程中作用的區(qū)別與聯(lián)絡(luò)，從而提醒其微觀作用機(jī)理，確定協(xié)同作用效果最正確的酶液組合；3有機(jī)固體廢物降解是由酶液及多種小分子物質(zhì)共同協(xié)作完成。利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在含有小分子物質(zhì)類別及數(shù)量不等的基質(zhì)環(huán)境下對酶蛋白進(jìn)展檢測，確定小分子物質(zhì)與酶液在堆肥過程中的協(xié)同作用機(jī)理，有助于進(jìn)步酶液降解有機(jī)固體廢物的效率；4有機(jī)固體廢物在降解過程中會(huì)發(fā)生物理形態(tài)等變化，實(shí)時(shí)檢測不同基質(zhì)條件變化下酶蛋白的作用位點(diǎn)及數(shù)量，對堆肥過程酶促降解作用的研究具有積極意

18、義。隨著技術(shù)的日趨成熟，進(jìn)一步進(jìn)步免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的定位檢測特異性及定量檢測準(zhǔn)確性，將使該技術(shù)在深化認(rèn)識生物酶蛋白作用機(jī)制等堆肥檢測任務(wù)中發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1zengg,huangdl,huanggh,hutj,jiangxy,fengl,henyn,tangl,liuhl.biresuretehnlgy,2022,98(2):320326huang,hiangk,linzh,leekh,hanght.anal.he.,2022,80(5):14971504slt,geuze.jellbil,1981,90(2):533536faulkp,talrg.iunhe,1971,8(11)

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