PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)課件

1、1PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)白雪麗山東省立醫(yī)院檢驗(yàn)科2PCR測定的技術(shù)要點(diǎn)PCR的定義PCR的基本原理PCR反應(yīng)的基本成分及其對結(jié)果的影響PCR反應(yīng)的基本條件及其對結(jié)果的影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)PCR假陽性與假陰性的預(yù)防對策3PCR的定義PCR （ polymerase chain reaction)即聚合酶鏈反應(yīng)，是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴(kuò)增DNA或RNA片段的技術(shù)。它能把極微量的遺傳物質(zhì)迅速而簡便的擴(kuò)增百萬倍，使原來無法分析和檢測的各種項(xiàng)目得以完成，它的問世，為傳統(tǒng)基因分析和診斷技術(shù)帶來了變革。5PCR的基本原理6PCR的基本原理 利用 DNA分子

2、能夠變性與復(fù)性的特性，以待擴(kuò)增的兩條DNA鏈為模板，由一對引物介導(dǎo)，以4種dNTP為底物，經(jīng)DNA多聚酶催化，在體外快速擴(kuò)增特異性DNA序列 。 7PCR原理示意圖9095變性4060退火 7075 延伸第一循環(huán)第二循環(huán)模板變性、退火延伸第三循環(huán)變性、退火、延伸總擴(kuò)增產(chǎn)物：2n倍增加長片段序列：2n倍增加目的DNA： 2n -2n 倍增加目的DNA533553538PCR反應(yīng)的基本成分及其對結(jié)果的影響緩沖液引物脫氧核糖核苷三磷酸（dATP dTTP dGTP dCTP)模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+PCR反應(yīng)體系： 30100l10引物引物大小上下游引物均為人工合成20nt左右的寡核苷酸

3、單鏈引物濃度一般在0.11mol/l濃度過高，非特異性增加濃度過低，敏感性下降引物特異性引物特異性決定擴(kuò)增的特異性，不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性12模板種類 DNA或RNA濃度 102 copies/ml 純度 標(biāo)本需要純化14TaqDNA聚合酶一般30100l 反應(yīng)體系中需加入12U 濃度過高，非特異性增加 濃度過低，產(chǎn)物量降低15Mg2+一般為1.5mmol/l,為Taq酶活性所必需的濃度過高，非特異性增加濃度過低，產(chǎn)物量降低16PCR反應(yīng)條件及對結(jié)果的影響17PCR反應(yīng)條件及對結(jié)果的影響變性溫度與時(shí)間復(fù)性溫度與時(shí)間延伸溫度與時(shí)間循環(huán)數(shù)18復(fù)性溫度與時(shí)間復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)

4、性越好，但容易出現(xiàn)錯(cuò)配，增加非特異性結(jié)合。溫度太高不利于復(fù)性，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55 左右，時(shí)間30S。20延伸溫度與時(shí)間引物延伸溫度一般為72 。因?yàn)樵谶@個(gè)溫度下Taq酶有較高的活性，并且引物和模板的結(jié)合較為穩(wěn)定。一般72 延伸1min對于 1kb以內(nèi)的擴(kuò)增片段就已足夠，如果擴(kuò)增片段1kb，延伸時(shí)間可相應(yīng)延長。21PCRPCR擴(kuò)增曲線23PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析技術(shù)24凝膠電泳分析技術(shù)主要包括瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。其中瓊脂糖凝膠電泳因操作簡單，較常用，一般采用濃度為 12%的瓊脂糖凝膠。通過電泳分析技術(shù)可直接觀察到有無擴(kuò)增產(chǎn)物，及產(chǎn)物片段的大小。可用于擴(kuò)增產(chǎn)物的定性分析。

5、26HCMV PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果 594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM 1 2 327探針雜交技術(shù)探針（probe)是通過一定手段標(biāo)記的已知核酸序列。探針雜交技術(shù)的原理：在一定條件下擴(kuò)增產(chǎn)物與其特異性同源探針可按堿基互補(bǔ)原則形成雜交鏈，通過對其中探針信號(hào)的檢測來獲得產(chǎn)物的信息。28膜上雜交技術(shù)通常采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。基本操作是將待測核酸片段通過凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)印到膜上或直接點(diǎn)樣于膜上再與探針進(jìn)行雜交，然后經(jīng)過漂洗、顯色得到檢測結(jié)果。（Southern 印跡、Northern印跡、斑點(diǎn)雜交）可對產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，但對操作要求較高，一般只適用于科研工作。30膜上

6、雜交技術(shù)檢測結(jié)果31微孔板雜交技術(shù)類似于ELISA技術(shù)中的雙抗體夾心法。首先通過微孔板孔壁上包被的捕獲探針來捕獲PCR產(chǎn)物。然后再用帶有標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物另一區(qū)域雜交，經(jīng)過漂洗顯色即可判斷結(jié)果?？捎妹笜?biāo)儀判讀，用于半定量測定。但整個(gè)操作過程不是全封閉的，易造成擴(kuò)增產(chǎn)物污染。32微孔板雜交技術(shù)原理示意圖雜交雜交洗板顯色雜交洗板顯色33熒光探針雜交技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，我們通常所說的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)多采用的該項(xiàng)技術(shù)，該技術(shù)反應(yīng)體系中除常規(guī)引物外，還引入了熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針，探針可與模板一對一結(jié)合。包括：Taqman技術(shù)Lightcycler技術(shù)Molecular beac

7、on 技術(shù)34Taqman技術(shù)原理reporterquencher35熒光探針雜交技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：在全封閉條件下進(jìn)行PCR定量，有效防止了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。實(shí)時(shí)監(jiān)測，熒光定量，結(jié)果直觀，定量準(zhǔn)確。結(jié)合了PCR技術(shù)與探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。36PCR技術(shù)的應(yīng)用37PCR的應(yīng)用科研：基因重組、蛋白表達(dá)DNA測序基因突變和重組的研究分子進(jìn)化和種系發(fā)育的研究臨床：感染性疾病的病原體檢測遺傳性疾病的診斷器官移植中的基因配型癌基因的檢測38PCR在病原體檢測中的優(yōu)缺點(diǎn)39優(yōu)點(diǎn):靈敏度高102 copies/ml即可，斑點(diǎn)雜交敏感性為105 copies/ml 特異性強(qiáng)主要由引物特異性決定，對于一個(gè)

8、20nt的引物其非特異性配對的概率為1/4 20。PCR可以克服血清學(xué)診斷中存在的交叉反應(yīng)可早診斷可在免疫學(xué)診斷窗口期就早期診斷不受患者免疫狀態(tài)的影響PCR可對病原體進(jìn)行定量分析并可對病原體進(jìn)行基因分型，指導(dǎo)臨床用藥和治療。40不足之處：操作復(fù)雜，技術(shù)不易被熟練掌握價(jià)格昂貴存在假陽性和假陰性結(jié)果41PCR假陽性和假陰性產(chǎn)生的原因和預(yù)防對策42假陽性產(chǎn)生的原因假陽性多為污染所致，包括：產(chǎn)物的污染樣品的交叉污染重組質(zhì)?；蚺囵B(yǎng)物及其它的污染43假陽性的防范措施PCR實(shí)驗(yàn)室要有嚴(yán)格的分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物檢測區(qū)）要建立規(guī)范化的操作程序，并嚴(yán)格按程序操作。吸取標(biāo)本時(shí)使用帶濾塞的吸頭試

9、驗(yàn)前后用紫外線燈照射工作臺(tái)面和室內(nèi)設(shè)施注意實(shí)驗(yàn)室的定期通風(fēng)使用防“污染”的PCR試劑(含UNG）44尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： 可防止以前擴(kuò)增產(chǎn)物對下一次PCR反映的影響。是一個(gè)連續(xù)的防污染過程。每次實(shí)驗(yàn)都必須使用。一般對103104拷貝/ml的產(chǎn)物污染有效。在反應(yīng)體系中用dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中含大量dU，在下一次PCR反應(yīng)中反應(yīng)體系中加入U(xiǎn)NG可去除dU，加熱后產(chǎn)物鏈斷裂，不能作為PCR反應(yīng)的模板，而UNG在PCR循環(huán)高溫變性一步就會(huì)失活，所以，對含dU的新合成PCR產(chǎn)物沒有影響 。45 T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A

10、A 加熱 A A A PCR46出現(xiàn)污染后的對策積極尋找污染源徹底清潔工作環(huán)境、器械和儀器紫外照射工作臺(tái)面及工作區(qū)徹底通風(fēng)47假陰性產(chǎn)生的原因操作不當(dāng)試劑質(zhì)量差或過期儀器設(shè)備不準(zhǔn)確其他48標(biāo)本的采集和處理49標(biāo)本的采集標(biāo)本采集的時(shí)間標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本的類型和采集量采集標(biāo)本的質(zhì)量采集及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集中的防污染50標(biāo)本采集的時(shí)間在疾病發(fā)展過程中，標(biāo)本采集過早或過晚都會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。51標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備采集部位的清潔消毒可去除微生物和其它雜物，但應(yīng)適度，過度消毒可能會(huì)破壞靶微生物。52標(biāo)本的類型和采集量標(biāo)本采集類型要根據(jù)所檢測的病原體而定，不同病原體存在部位不同，采集標(biāo)本種類也就不同。53

11、采集標(biāo)本的質(zhì)量標(biāo)本采集后，要對標(biāo)本采集質(zhì)量作出評價(jià)血液標(biāo)本應(yīng)觀察有無溶血、脂血對于痰液、體液及分泌物標(biāo)本，可先取少許標(biāo)本離心，取沉淀鏡下觀察有無細(xì)胞及所需類型細(xì)胞數(shù)量54采集及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集要采用一次性材料，運(yùn)輸要求為密閉一次性裝置。如需使用抗凝劑，一般采用EDTA或枸櫞酸鹽，因肝素對PCR反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用，且在核酸提取過程中難以去除55標(biāo)本采集中的防污染采集過程中操作者應(yīng)注意防范，避免在標(biāo)本中混入操作者的毛發(fā)、表皮細(xì)胞、痰液56標(biāo)本的處理57標(biāo)本的處理全血標(biāo)本EDTA-Na2或枸櫞酸鈉抗凝，不可使用肝素提取DNA檢測，可4 短期保存檢測RNA，應(yīng)在取血后立即提取RNA，或保存于RNA提

12、取液中。58標(biāo)本的處理血清室溫待血自然凝固，離心分離血清，可在4 短期保存（36hr內(nèi)使用），提取DNA提取RNA則應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)分離血清，立即提取RNA59標(biāo)本的處理外周血單個(gè)核細(xì)胞EDTA-Na2或枸櫞酸鈉抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液，離心分離EDTA-Na2或枸櫞酸鈉抗凝，裂解全血中的紅細(xì)胞洗滌后可存于-70 以下60標(biāo)本的處理痰測定結(jié)核菌DNA，液化痰液，不能加熱液化劑：二硫蘇糖醇，或0.5%N-乙酸-L半光氨+1.45%枸櫞酸鈉+2%NaOH非結(jié)核菌，痰與生理鹽水震蕩混勻，自然沉淀后，取上清離心，沉淀物用于DNA提取痰中有血：必須加紅細(xì)胞裂解液61標(biāo)本的處理拭子拭子于適量生理鹽水中充分震蕩洗滌，室溫靜置510分鐘后，取上清離心，沉淀用于DNA提取62標(biāo)本的處理膿液水樣膿液可直接離心，取沉淀提取DNA粘稠膿液的處理如同痰液處理63標(biāo)本的處理體液胸水、腹水、腦脊液、羊水、尿液等直接離心，取沉淀作DNA提取血性者應(yīng)先行紅細(xì)胞裂解預(yù)處理后的標(biāo)本可4 短期存放，也可保存于-70 以下64標(biāo)本的處理新鮮組織生理鹽水洗滌后，切碎，加入適量生理鹽水制成組織勻漿，離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后，用酚-氯仿法提取DNA 50%乙醇中，1cm小片的組織，4 下可保存