細菌內(nèi)毒素檢查9.細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗

1、細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗湛江安度斯生物有限公司2017年5月1（一）細菌內(nèi)毒素滅活驗證試驗1.目的：證明干熱除熱原過程的有效性。2.驗證項目及標準 一般將不小于1000單位的細菌內(nèi)毒素加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個對數(shù)單位。3.方法（見內(nèi)毒素指示劑使用方法）4.依據(jù)：CHP2015年版附錄通則1421滅菌法-干熱滅菌法2（二）內(nèi)毒素指示劑成分：從大腸桿菌提取的內(nèi)毒素效價：見效價分析報告書用途：用于干熱滅活內(nèi)毒素程序的驗證規(guī)格：2ml/支安瓿或5ml/支安瓿3（二）內(nèi)毒素指示劑使用方法1.保留12支指示劑作為未經(jīng)干熱對照品；2.除去指示劑標簽，開啟；3.在鋁箔紙上做好

2、標記，封閉瓶口；4.干熱烘箱：把指示劑放置在烤箱的不同位置，依據(jù)烤箱的大小及冷點分布情況來確定指示劑的數(shù)量，一般放置1015個點（角落、中間點、冷點）。指示劑應與除熱原物料夾放在一起；45.按滅活內(nèi)毒素程序進行干烤（*最差裝載）；6.對經(jīng)滅活程序后的指示劑進行鱟試驗測試；7.各干烤點的數(shù)據(jù)分析。5凝膠限度法分析方法凝膠法定量法凝膠半定量法*最差裝載：最大裝載和最難被熱穿透的物品組合。（二）內(nèi)毒素指示劑分析方法舉例內(nèi)毒素指示劑：標示效價 1250EU/支鱟試劑：標示靈敏度（） 0.125EU/ml6內(nèi)毒素指示劑使用時要注意查看鱟試劑的批號是否和效價測定報告書的批號一致！7加入BET水的量和混合的

3、時間鱟試劑批號分析方法舉例（凝膠限度法）陽性對照：將未經(jīng)干熱的指示劑按標示效價稀釋至0.25EU/ml（2）81.8ml30s12.5EU/ml30s 30s1250EU/ml0.2ml指示劑BET水1.0ml125EU/ml0.2ml1.8ml1.25EU/ml0.2ml1.8ml30s0.4ml0.25EU/ml1.6ml5，000倍混合10分鐘內(nèi)毒素指示劑加入BET水的量和混合的時間參照效價測定報告書樣品：經(jīng)干熱的指示劑經(jīng)干熱的指示劑按標示效價稀釋至125EU/ml或者原液1250EU/ml檢測9 30sS10.2ml指示劑BET水1.0mlS101.8ml混合10分鐘檢測項目陰性對照陽

4、性對照樣品（125EU/ml）樣品（1250EU/ml）4數(shù)量級分析，非必需結(jié)果分析及判斷檢測項目陰性對照陽性對照樣品（125EU/ml）試驗有效！樣品（125EU/ml）樣品（125EU/ml）樣品（125EU/ml） + +下降1000倍，符合規(guī)定！不符合規(guī)定！不符合規(guī)定！9未經(jīng)干熱的指示劑效價確認（按標示效價稀釋至2、/2、/4）分析方法舉例（凝膠半定量法）110.125EU/ml1.0ml1.0ml0.06EU/ml30s1.0ml1.0ml0.03EU/ml30s1.0ml1.0ml0.25EU/ml1.6ml10000倍20000倍40000倍5000倍1.8ml30s12.5EU

5、/ml30s 30s1250EU/ml0.2ml指示劑BET水1.0ml125EU/ml0.2ml1.8ml1.25EU/ml0.2ml1.8ml30s0.4ml混合10分鐘內(nèi)毒素指示劑加入BET水的量和混合的時間參照效價測定報告書30s經(jīng)干熱的指示劑經(jīng)干熱的指示劑需稀釋至出現(xiàn)陰性結(jié)果的濃度12 30sS10.2ml指示劑BET水1.0mlS101.8ml混合10分鐘結(jié)果計算及判斷可回收內(nèi)毒素量13未經(jīng)干熱的指示劑反應終點倍數(shù)未經(jīng)干熱指示劑每瓶含量（EU/瓶)稀釋倍數(shù)5000100002000040000平行管200000.125X20000X1.0=2500100000.125X10000X

6、1.0=1250Rc = antilg2lg2500+lg1250= 1767.8(EU/瓶)經(jīng)干熱的指示劑（稀釋倍數(shù)）反應終點倍數(shù)經(jīng)干熱指示劑每瓶含量（EU/瓶)1（4數(shù)量級驗證）10（3數(shù)量級驗證）平行管 1 0.125X1X1.0= 0.1251 0.125X1X1.0 = 0.125殘余內(nèi)毒素量Rs antilg2lg0.125+lg0.125即Rs0.125(EU/瓶)14內(nèi)毒素衰減 lgRd = lgRc-lgRs = lg1767.8 - lg0.125= 4.15中國藥典要求lgRd 3分析方法舉例（定量法）動態(tài)濁度法/動態(tài)顯色法制備標準曲線 例如5、0.5、0.05EU/ml反應溶液制備：未經(jīng)干熱內(nèi)毒素指示劑溶液稀釋到0.5EU/ml；經(jīng)干熱內(nèi)毒素指示劑溶液直接檢測原液；計算Rc、Rs、和lgRd14分析方法舉例（定量法）例如：Rc=1250EU/瓶；Rs0.05EU/瓶； lgRdlg1250-lg0.054.415問題討論1.為什么要使用指定批號的鱟試劑？可不可以用同靈敏度的鱟試劑替代？內(nèi)毒素指示劑的效價是