酶聯(lián)免疫吸附試驗全解

1、酶朕免疫及附試殮簡介1971年，一住瑞典學(xué)者和一後椅魚學(xué)者分別掖道將免疫技術(shù)發(fā)襄為檢測體液中橄量暢質(zhì)的闔相免疫測走方出，隸礫聯(lián)免疫吸附試臉(ELISA)ELISAst是將抗慮和抗體的免疫反應(yīng)和馨的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新找術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可徐性抗原抗體糸統(tǒng)的可用以檢測。ELISA出是免疫診新中的一項新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生暢所引超的傳染病.畫生玄病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗廉和小分子抗廉的走童測走，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認為ELISA法具有靈敎、特異.簡單.快速、穩(wěn)定及易于偷動化操作等特氏。不倪適用子臨床標本的檢查，而且由子-天之內(nèi)可以檢查幾

2、百芯至上千份標本,因此，也適合于血請流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測走抗體，而且也可用于測走體液中的循環(huán)抗凍，所以也是一種早期診斷的良好方宙。IfLJ汽本原理先將已知的抗體或抗點結(jié)合蠱禁種固相載體上,并鐳持其免疫活性。測走對P將待檢樣本和酶標抗凍或抗體挨不同步驟與固相栽體表面吸附的抗體或抗凍發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方肉洗去多余的分富抗慮抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底暢催化顯色，進行定性或走量測走。反應(yīng)模式酶聯(lián)免疫及附試臉的主要技術(shù)類型有鞏抗體夾心出、間接出、丸爭出、捕獲出、生楊素親和素等。1,雙抗體夾心法:此出帚用于檢測執(zhí)屢它是檢測抗廉最常用的ELISA,適用于檢測分子中具有至少兩個抗慮決

3、定簇的多價抗廉，而不能用于小分子豐抗廉的檢測。2，間接法測定抗體此肉帝用于測剣抗體將已知抗慮連接蠱固相載體上，待測抗體與抗廉結(jié)合后再與酶標二抗結(jié)合，形成抗斥待測抗體酶標二抗的復(fù)合暢,復(fù)合楊的形成童與待測抗體量成正比屬非丸爭性反應(yīng)類型。3，競爭法此肉既可用于檢測抗慮和半抗原的定量測走，也可用于測走抗體用酶標抗慮（抗體丿與待測的非標記抗廉（抗體丿丸爭性的與固相載體上的限童抗體（抗凍丿結(jié)合，待測抗慮C抗體丿多，則形成非標記復(fù)合楊多，酶標抗慮與抗體結(jié)合就少，也就旻酶標記復(fù)合楊少，因此，顯色程度與待測楊含童成反比。I如j列4,捕獲法（反向間接法）主要用于測定血請中禁種抗體亞成分以目前最帯用的igM測定為

4、例，因血請中針對禁種抗廉的特異性IgM和IgG同對存癥，而后者可干擾igM的測走。因此，先針對igM的第二抗體連接于固相栽體，用以“嫦獲”樣嬴中所有igM；洗滌除去igG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗嫖與待測IgM結(jié)合；再次加入抗慮特異的礫標抗體;最后形成固相二抗-IgM-抗療酶標抗體復(fù)合腸，加酶底場顯色后，即可對待IgM進行定性和定量測定。、込、*5,生物素-親和素ABS為桌和素.生楊素糸統(tǒng)的略語。桌和素與生腸素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強，桌和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)走。由于個索和素分子有4個生暢素分子的結(jié)合後置,可以連接更多的生暢素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把索和素和

5、生場素與EL1S偶朕起來，就可大提高EL1SA的牧感度。這種包被出不僅可增加及附的抗體或抗凍童,而且使其結(jié)合點充分暴彖。另外，農(nóng)常規(guī)EL1SA中的酶標抗體也可用生楊素化的抗體槨代，然后連接桌和素-酶結(jié)合物f以放大反應(yīng)信試劑組成：1包被板：包被有被檢物質(zhì)的抗原（抗體）2陰陽對照：主要為含被檢物質(zhì)的陰性陽性血清3酶標工作液：HRP（辣根過氧化物酶）4底物液A、B：TMB（四甲基聯(lián)苯胺）5終止液：2MH2SO46濃縮洗滌液:PBS（磷酸鹽緩沖液）儀器：3.PH0MO酶標儀1加樣槍具體步驟1包被:將特異性抗體包被固相載體孵育一定時間，使形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)2加待檢樣本：孵育使標本中

6、的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。3加入酶標抗體：孵育，使形成固相抗體待測抗原酶標抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合酶標抗體。4加入底物：顯色固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物通過比色，測標本中抗原的量。5加入終止：終止反應(yīng)6結(jié)果判定：將酶標板放入酶標儀中，根據(jù)要求調(diào)整測量波長,在根據(jù)開單要求報定性定量值即可。1標本的影響嫁血，脂血標本請ELISA肉檢測易卜生假陽性標本受細菌活染標本保存不自塑舞試管能吸附抗慮物質(zhì)，樣本久置蠱塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含童下陣蓮応假陰性JII-r山4代尸尸US/，*標本凝固不全2試劑影響ELISA檢測狀利廠家較多；因選用國家就

7、準丈號，不同廠家出產(chǎn)的試制靈做度與特異性存磁一走的差別，使用質(zhì)龍的試利必然導(dǎo)敷結(jié)果的假陽性或假陰性。試劉因姿曇櫬管癥4C冰箔內(nèi)，使用裔要怨平衡童廈。不同馳號試利不能混用。因此，選擇高質(zhì)童的試利是保證結(jié)果準確的關(guān)錢O3操作技術(shù)的影響哌童的準確性狹量不準確，直接影響檢測結(jié)果。因此加樣春也要經(jīng)常請洗P走期牧準廈浴影響抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對at度有嚴格要求。加擇次序影響有對我們在加樣過程中，帶帶會遇到個別標本未窩心等惜況，為了節(jié)細對間，往往這對我們會先加礫結(jié)合腸，然后等標本分富好后再加標本，這樣帝帝會凌成假陰性。洗滌方肉對結(jié)果的彩響冼滌旻ELISA操作的重要環(huán)節(jié)手洗條件一政性較差，4干擾物質(zhì)的影響大約40%的人血請標本中含有非特異性干擾賜質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾暢質(zhì)有：類庵濕因子、補體、交叉反應(yīng)楊質(zhì)和其他暢質(zhì)等藥物的影響：如有些富敗價的免疫球姜等應(yīng)用ELISAS由于測定靈敘.特異.操作簡便.酶標記試利比較穩(wěn)走.易于令動化.無反射性汚染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶朕，使