乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法沙門氏菌的檢驗(yàn)

1、乳與乳制品病原微生物檢驗(yàn)方法沙門氏菌的檢驗(yàn) YLNB 4.3方法一：國(guó)標(biāo)法1. 儀器及器材1.1 冰箱：0-41.2 恒溫培養(yǎng)箱：3611.3 顯微鏡：10100均質(zhì)器或滅菌乳缽天平：0-500g，精度0.5g滅菌試管：10mm100mm、16mm160mm滅菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）滅菌錐形瓶：500ml、100ml滅菌培養(yǎng)皿：直徑90cm滅菌小試管：3mm50mm滅菌毛細(xì)管。2. 培養(yǎng)基和試劑2.1緩沖蛋白胨水(BP)：按GB 4789.28中4.12規(guī)定。2.2 氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液：按GB 4789.28中4.13規(guī)定。2.3 四硫酸鈉煌綠

2、(TTB)增菌液：按GB 4789.28中4.14、4.15規(guī)定。2.4 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液：按GB 4789.28中4.16規(guī)定。2.5 亞硫酸鉍瓊脂(BS)：按GB 4789.28中4.19規(guī)定。2.6 DHL瓊脂：按GB 4789.28中4.20規(guī)定。2.7 HE瓊脂：按GB 4789.28中4.21規(guī)定。2.8 WS瓊脂：按GB 4789.28中4.23規(guī)定。2.9 SS瓊脂：按GB 4789.28中4.22規(guī)定。2.10 三糖鐵瓊脂：按GB 4789.28中4.26，4.27規(guī)定。2.11 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑：按GB 4789.28中3.13規(guī)定。2.12 尿素瓊脂(pH

3、7.2)：按GB 4789.28中3.15規(guī)定。2.13 氰化鉀(KCN)培養(yǎng)基：按GB 4789.28中3.16規(guī)定。2.14 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：按GB 4789.28中3.12規(guī)定。2.15 糖發(fā)酵管：按GB 4789.28中3.2規(guī)定。2.16 ONPG培養(yǎng)基：按GB 4789.28中3.3規(guī)定。2.17 半固體瓊脂：按GB 4789.28中4.30規(guī)定。2.18 丙二酸鈉培養(yǎng)基：按GB 4789.28中3.7規(guī)定。2.19 沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進(jìn)一步分型；163種用。3. 檢驗(yàn)程序 直接增菌法鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品 25g+滅菌生理鹽水

4、25ml,做成檢樣勻液前增菌法凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25g+BP 225ml361 一般4h 干蛋品18 h24h 檢樣勻液25ml+SC 100ml檢樣勻液25ml+MM（或TTB)100ml10ml+SC100ml10ml+MMA(或TTB)100ml42 18 h24h 361 18 h24h 42 18 h24h 361 1824hBSDHL(或HE、WS、SS)361 40h48h 36140h-48h挑取可疑菌落TSI(斜面、底層、產(chǎn)氣、H2S),蛋白胨水（靛基質(zhì)），尿素（PH7.2），KCN，賴氨酸非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果H2S 靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+/-H2S+ 靛基

5、質(zhì)+尿素KCN賴氨酸+H2S+ 靛基質(zhì)尿素KCN賴氨酸+ ONPG甘露醇沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)非沙門氏菌非沙門氏菌沙門氏菌血清學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào) 告4. 方法4.1 前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應(yīng)經(jīng)過前增菌。各稱取檢樣25g，加在裝有225mL緩沖蛋白陳水的500mL廣口瓶?jī)?nèi)。固體食品可先應(yīng)用均質(zhì)器以800010000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化，于361培養(yǎng)4h(干蛋品培養(yǎng)1824h)，移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42培養(yǎng)1824h。同時(shí)，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽骯氨酸增菌液內(nèi)，于

6、361培養(yǎng)1824h。鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經(jīng)加工的食品不必經(jīng)過前增菌。各取25g(25mL)加入滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液；取25mL，接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42培養(yǎng)24h；另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于361培養(yǎng)1824h。4.2 分離取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)亞硫酸鉍瓊脂平板和一個(gè)DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)。兩種增菌液可同時(shí)劃線接種在同一個(gè)平板上。于361分別培養(yǎng)1824h(DHL、HE、WS、SS)或4048h(BS)，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，沙門氏菌、和沙門氏菌在各個(gè)平板上的

7、菌落特征見表1。表1沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征于詳細(xì)分型。選擇性瓊脂平板沙門氏菌、沙門氏菌（即亞利桑那菌）亞硫酸鉍瓊脂產(chǎn)硫化氫菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變黑色有金屬光澤DHL瓊脂無(wú)色半透明，產(chǎn)硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株與沙門氏菌、相同；乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，帶中心帶黑色HE、WS瓊脂藍(lán)綠色或藍(lán)色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色乳糖陽(yáng)性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎黑色；乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株為藍(lán)綠色或藍(lán)色，中心黑色或幾乎全黑色SS瓊脂無(wú)色半

8、透明，產(chǎn)硫化氫菌株有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養(yǎng)基明顯乳糖遲緩陽(yáng)性或陰性的菌株，與沙門氏菌、相同；乳糖陽(yáng)性的菌株為粉紅色，帶中心帶黑色，但中心無(wú)黑色形成時(shí)與大腸艾希氏菌不能區(qū)別對(duì)可疑的菌落可挑取單菌落做沙門氏菌全套生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)。4.3 生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)按照GB/T4789.4-2003進(jìn)行。5. 結(jié)果報(bào)告如果在各種選擇性培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)，則報(bào)告“陰性”或“未檢出”；如果有可疑菌落出現(xiàn)，可報(bào)告“有可疑菌落”或進(jìn)一步做生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)鑒定后報(bào)告“陰性”或“陽(yáng)性”。方法二：顯色培養(yǎng)基法1. 儀器及器材 恒溫培養(yǎng)箱：361 水浴鍋：420.2 滅菌錐形瓶：300ml、500ml

9、滅菌吸管：1ml、10ml 滅菌培養(yǎng)皿：90mm2. 培養(yǎng)基和試劑 緩沖蛋白胨水（BP）：蛋白胨 10g氯化鈉 5g磷酸氫二鈉（NaHPO4.12H2O） 9g磷酸二氫鈉 1.5g蒸餾水 1000mlPH7.2以每瓶225ml分裝于300ml錐形瓶中，121高壓滅菌15min備用。 RVS增菌肉湯： 沙門氏顯色培養(yǎng)基： 營(yíng)養(yǎng)瓊脂： 全套生化試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)試劑：見GB/T4789.4-20033. 方法 以無(wú)菌操作取25g（ml），加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的300ml錐形瓶中（有玻璃珠數(shù)粒），搖動(dòng)數(shù)分鐘，使樣品完全溶解。 吸取1ml樣品液加入9mlRVS肉湯中，在420.2的水浴鍋或培養(yǎng)箱內(nèi)，增菌培養(yǎng)242小時(shí)。 用3mm接種環(huán)取1環(huán)增菌液，劃線接種到沙門氏顯色培養(yǎng)基上，做2個(gè)重復(fù)。 361培養(yǎng)24-28小時(shí)，觀察菌落形態(tài)。 沙門氏菌（傷寒沙門氏菌除外）顯亮紅色，大腸桿菌和大腸菌群顯藍(lán)色，枸櫞酸桿菌顯紫色，其它細(xì)菌顯黃色或無(wú)色。 對(duì)可疑的菌落可劃線到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，361培養(yǎng)1