細菌鑒定技術-臨床微生物學和微生物學檢驗

1、細菌鑒定技術南華大學預防醫(yī)學與放射衛(wèi)生實驗教學中心教學對象：高等醫(yī)學院校衛(wèi)生檢驗專業(yè)學生實驗課時：4學時課程類型：專業(yè)實驗課課程要求：必修每組人數(shù)：2人實驗目的和要求掌握鑒別細菌常用生化反應的原理和結果判定。熟悉鑒別細菌常用生化反應的培養(yǎng)基、方法和意義。熟悉數(shù)字編碼鑒定技術的原理和結果判斷。了解細菌數(shù)字編碼技術操作和臨床意義。 實驗內(nèi)容生化反應培養(yǎng)基的制備。常用細菌生化反應。數(shù)字編碼鑒定 。 一、生化反應培養(yǎng)基的制備不同生化反應需選擇不同生化反應培養(yǎng)基。按相應培養(yǎng)基配方及配制要求，制備所需生化反應培養(yǎng)基。制備方法同培養(yǎng)基制備技術二、常用細菌生化反應糖發(fā)酵試驗吲哚試驗（靛基質(zhì)試驗）甲基紅試驗 V

2、-P（Voges-Proskauer）試驗 枸櫞酸鹽（或檸檬酸鹽）利用試驗克氏雙糖鐵（KIA）復合試驗 動力、吲哚及脲酶（MIU）復合試驗 1.糖發(fā)酵試驗【原理】：各種細菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，對糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后僅產(chǎn)酸，有的分解后產(chǎn)酸產(chǎn)氣，故可用來鑒別細菌。【方法】：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種葡萄糖、乳糖發(fā)酵管，35C培養(yǎng)18-24h 觀察結果。1.糖發(fā)酵試驗【結果】：首先確定細菌是否生長，細菌生長者培養(yǎng)基呈混濁狀：1）不分解糖，培養(yǎng)基顔色與接種前無變化，以“-”表示；2）分解糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，以“+”表示；3）分解糖產(chǎn)酸

3、產(chǎn)氣，除培養(yǎng)基顔色變化外，倒管中還有氣泡，以“”表示。2.吲哚試驗（靛基質(zhì)試驗）【原理】：有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，與吲哚試劑形成紅色化合物?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，35C18-24h后，加入吲哚試劑數(shù)滴，靜置分層，觀察結果?！窘Y果】：在培養(yǎng)物液面上層呈玫瑰紅色為陽性，不變色者為陰性。3.甲基紅試驗【原理】：某些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可進一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)，故培養(yǎng)基pH 在4.5以下，加入甲基紅指示劑后呈紅色（陽性）；有些細菌分解葡萄糖產(chǎn)生的酸進一步化為醇、酮等非酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH在6.2以上，加入甲基紅

4、指示劑后呈黃色（陰性）?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，35C18-24h，加入甲基紅指示劑2-3滴觀察結果。【結果】：紅色為陽性，黃色為陰性。 +4.V-P（Voges-Proskauer）試驗【原理】：某些細菌分解葡萄糖生成丙酮酸，進一步脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰，后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色胍縮二乙酰，為VP試驗陽性。若培養(yǎng)基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反應。【方法】：大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，35C，24-48h，加入VP試劑甲液和乙液各1滴，充分搖動，觀察?！窘Y果

5、】：紅色為陽性，若為陰性應再培養(yǎng)4h觀察，仍無紅色者為陰性。 +5.枸櫞酸鹽（或檸檬酸鹽）利用試驗【原理】：當細菌可以利用銨鹽作為唯一氮源，同時檸檬酸鹽為惟一碳源時，可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，使培養(yǎng)基變堿，指示劑溴麝香草酚藍由綠色變?yōu)樯钏{色為陽性，培養(yǎng)基不變色（綠色）為陰性?！痉椒ā浚捍竽c埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌分別接種于檸檬酸鹽培養(yǎng)基中，35C，24-48h，觀察?！窘Y果】：菌苔出現(xiàn)，培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{色為陽性。細菌不能生長，培養(yǎng)基不變色（綠色）為陰性。6.克氏雙糖鐵（KIA）復合試驗【原理】：該培養(yǎng)基用酚紅指示劑，在酸性時呈黃色，堿性時呈紅色。細菌如能發(fā)酵乳糖和葡萄糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣

6、，則斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。如只發(fā)酵葡萄糖不發(fā)酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接觸空氣而氧化揮發(fā)，從而使斜面部分保持原來的紅色；底層由于是在相對缺氧狀態(tài)下，細菌發(fā)酵葡萄糖所生成的酸類物質(zhì)不被氧化揮發(fā)而保持黃色。如細菌分解蛋白產(chǎn)生硫化氫，則與硫化亞鐵作用生成黑色的硫化鐵，使培養(yǎng)基變黑。6.克氏雙糖鐵（KIA）復合試驗【方法】：將待檢菌接種于克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（底層穿刺，上層斜面劃線），35C，24h，觀察。【結果】：發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則上層和底層均呈黃色且有氣泡產(chǎn)生；只發(fā)酵葡萄糖而不發(fā)酵乳糖，則底層變黃，上層仍為紅色。如底層變黑，說明該菌產(chǎn)生硫化氫，生成黑色的硫化鐵沉淀。

7、雙糖鐵培養(yǎng)基標準管痢疾桿菌KA 傷寒桿菌KA 大腸桿菌AA7.動力、吲哚及脲酶（MIU）復合試驗【原理】：培養(yǎng)基為含尿素、蛋白胨的半固體培養(yǎng)基，指示劑為酚紅。具色氨酸酶的細菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，加入吲哚試劑后，培養(yǎng)基上層的吲哚會變紅；具脲酶的細菌能分解尿素產(chǎn)氨，使整個培養(yǎng)基變堿呈紅色；有動力的細菌沿穿刺線擴散生長。【方法】：將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培養(yǎng)基，35C，18-24h，觀察動力和脲酶反應后，再滴加吲哚試劑。 【結果】：擴散生長為動力陽性；滴加吲哚試劑后呈玫瑰紅色為陽性；培養(yǎng)基變紅脲酶陽性。大腸埃希菌MIU（）三、數(shù)字編碼鑒定【原理】：數(shù)字編碼鑒定技術，是計算并比較數(shù)據(jù)庫內(nèi)每個細菌條目對系統(tǒng)中每個生化反應出現(xiàn)頻率總和。計算單項發(fā)生頻率和多項發(fā)頻率，得出鑒定百分率（%id），按鑒定百分率排序、查碼。三、數(shù)字編碼鑒定【具體內(nèi)容】：是將鑒別細菌的各種生化反應微量化與綜合系列化，將各種生化反應培養(yǎng)基分裝在微量板或微量管內(nèi)，組成