單細胞培養(yǎng)講稿

1、關(guān)于單細胞培養(yǎng)第一張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月單細胞培養(yǎng)細胞懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)第二張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 第5章 單細胞培養(yǎng)及突變體篩選 1 細胞培養(yǎng) 2 單細胞的分離 3 單細胞的培養(yǎng)方法 4 突變體的篩選第三張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1 細胞培養(yǎng)1.1 細胞培養(yǎng)：將植物體或其培養(yǎng)物游離的細胞或小細胞團進行培養(yǎng)的方法。 培養(yǎng)方式 單細胞培養(yǎng) 懸浮細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)對象 細胞個體 細胞群體 培養(yǎng)產(chǎn)物 單細胞克隆系 次生代謝產(chǎn)物 酶制劑、人工種子等 應(yīng)用領(lǐng)域 篩選突變體， 食品、藥品、工業(yè)原料、 細胞學(xué)研究， 農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 進行遺傳操作 第四張，PPT共三

2、十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1.2細胞培養(yǎng)的意義：細胞懸浮培養(yǎng)植株人工種子原生質(zhì)體有用次生代謝產(chǎn)物突變體的篩選第五張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2 單細胞的分離分離的單細胞平板培養(yǎng)看護培養(yǎng)飼養(yǎng)培養(yǎng)微室培養(yǎng)單細胞無性系第六張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 由外植體直接分離物理法：葉片搗碎過濾、離心收集細胞酶解法：酶解果膠酶、纖維素酶外植體具有代謝活性的細胞注：必須對細胞進行滲透壓的保護第七張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.2 由愈傷組織獲得固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)過篩單細胞體系外植體獲得愈傷組織，并多次繼代懸浮細胞高鹽分、高生長素第八張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2

3、022年6月要求：松散性好，增殖快，再生能力強。其外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。 適于懸浮培養(yǎng) 適于再生植株第九張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點：細胞團成小細胞團或單細胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。注：由愈傷組織分離單細胞的關(guān)鍵是獲得均一、松散的適合懸浮培養(yǎng)的愈傷組織第十張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2、單細胞培養(yǎng)方法：2.1培養(yǎng)方法 1）平板培養(yǎng)法 2）看護培養(yǎng)法 3）飼喂層培養(yǎng)法 4）微室培養(yǎng)法2.2 單細胞培養(yǎng)的影響因子 1）細胞植板密度 2

4、）培養(yǎng)基的成分第十二張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 培養(yǎng)方法：1）平板法（plating culture） （薄層培養(yǎng)）1960年Bergamann首創(chuàng)，是在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)單細胞的一種方法。第十三張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月I 細胞密度：指單位體積內(nèi)的細胞數(shù)量，是影響細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵因子。平板培養(yǎng)要求保證細胞密度為10 4 -10 5 個/ml 。II平板培養(yǎng)的效果用植板率來衡量。細胞密度和植板率植板率（plate efficiency） ：能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比例。PE =平板中新形成的細胞團

5、數(shù)/平板中接種的細胞數(shù)100 第十五張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：單細胞在培養(yǎng)基中分布較均勻，便于定點觀察，篩選效率高、量大，操作簡便缺點：通氣狀況不佳，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。 第十六張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2）看護培養(yǎng)1954年，Muir首次創(chuàng)立此法是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)分裂和增殖的一種培養(yǎng)方法，這塊愈傷組織被稱為看護組織 .愈傷組織不僅為細胞提供了營養(yǎng)，還提供了促進細胞分裂的某些物質(zhì)第十七張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十八張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：簡便、成功率高缺點：不能在

6、顯微鏡下直接觀察第十九張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3）飼養(yǎng)培養(yǎng)（feeder layer culture）：原理：平板法看護法 評價：單細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)的理想方法。注：飼養(yǎng)層細胞沒有種屬特異性。第二十張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4）微室培養(yǎng)（microchamberculture) 人工制造一個小室，將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法，稱為微室培養(yǎng)法。此法首先是由Jones等（1960）設(shè)計第二十一張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：可對細胞培養(yǎng)過程連續(xù)進行顯微觀察，了解一

7、個細胞經(jīng)過生長、分裂、分化，形成細胞團的全部過程。缺點：微室培養(yǎng)用的培養(yǎng)基量少，營養(yǎng)和水分就難以保持。pH值變動幅度大，培養(yǎng)的細胞僅能短期分裂。 第二十三張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2.2 單細胞培養(yǎng)的影響因子細胞密度培養(yǎng)基成分第二十四張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1） 細胞密度與培養(yǎng)基成分關(guān)系當(dāng)細胞植板密度高時（104105個/mL）可使用和愈傷組織培養(yǎng)相同的常規(guī)培養(yǎng)基當(dāng)細胞植板密度低時要求使用復(fù)雜培養(yǎng)基，常采用KM8P培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基，并結(jié)合使用看護培養(yǎng)、飼喂層培養(yǎng)等方法。第二十五張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月成分 數(shù)量（mgL-1） 成分 數(shù)量（

8、mgL-1） 成分 數(shù)量（mgL-1）NH4NO3 600 KNO3 1900 KCL 300 MgSO47H2O 300 CaCL22H2O 600 KH2PO4 170 KI 0.75 H3BO3 3.00 ZnSO47H2O 2.00 MnSO4H2O 10.00 Na2MO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025CoCL26H2O 0.025 NaFeEDTA 28 葡萄糖 68400 甘露糖 125 蔗糖 125 鼠李糖 125 果糖 125 纖維二糖 125核糖 125 山梨醇 125 木糖 125 甘露醇 125 丙酮酸鈉 5 蘋果酸 10 檸檬酸 10 延胡索酸 1

9、0肌醇 100 生物素 0.005 尼克酰胺 1氯化膽堿 0.5 鹽酸吡哆醇 1 核黃酸 0.1鹽酸硫胺素 10 抗壞血酸 1 D-泛酸鈣 0.5維生素A 0.005 葉酸 0.2 維生素D3 0.005P-對氨基苯甲酸 0.01 維生素B12 0.01水解酪蛋白 125 椰子汁 10 KM-8P第二十六張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）細胞密度直接決定細胞分裂與否：細胞分裂要求細胞密度達到一定水平；細胞會產(chǎn)生某些物質(zhì)，并分泌到培養(yǎng)基中，只有當(dāng)這些物質(zhì)在培養(yǎng)基中達到一定的臨界水平，細胞分裂才啟動。第二十七張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月生長因子何種物質(zhì)？用量多少？簡化的

10、純合成培養(yǎng)基培養(yǎng)單細胞第二十八張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、應(yīng)用篩選細胞突變體3.1 突變體的特征自然界突變體發(fā)生頻率低突變體繼代多次都能穩(wěn)定遺傳突變體中具有相應(yīng)變化了的基因產(chǎn)物或生理生化代謝上的差異突變體細胞形成的再生植株能通過有性傳遞保證其突變型第二十九張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2 獲得突變體的方法自發(fā)突變（體細胞無性系變異）在組培過程中形成的再生植株表現(xiàn)出的遺傳變異特點：自發(fā)產(chǎn)生，無外在的選擇壓力；對于篩選目的突變體有一定的盲目性適應(yīng)材料：植物組培的培養(yǎng)物第三十張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月誘發(fā)突變?nèi)藶榈夭捎梦锢砗突瘜W(xué)因素，誘發(fā)生物體產(chǎn)生遺

11、傳物質(zhì)的突變，經(jīng)分離、選擇、培育成新品種的途徑方法：物理誘變、化學(xué)誘變對象：種子、營養(yǎng)器官、離體培養(yǎng)材料（愈傷組織、單細胞、原生質(zhì)體）第三十一張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3 細胞突變體篩選的優(yōu)點與意義（與整體植物相比）培養(yǎng)細胞壁薄, 缺乏角質(zhì)層和蠟質(zhì)層，且處在不斷分裂中， 比整體植物或種子更容易接受誘變；細胞水平誘變周期短，縮短育種年限 ；處理數(shù)目多，收率高；避免了整株水平上常出現(xiàn)的嵌合體；節(jié)省人力和物力進行選擇，篩選效率高；第三十二張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3.4 細胞突變體篩選的技術(shù)路線：選擇起始材料，獲得愈傷組織，制備單細胞懸浮系 人工誘變或自發(fā)突變 單

12、細胞突變體 篩選有益突變體 單細胞培養(yǎng)，獲得克隆 再分化 再生植株 突變株的鑒定 栽培 種苗表型： 抗除草劑、抗鹽堿、抗病、 抗氨基酸等第三十三張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）選擇方法直接選擇：將培養(yǎng)細胞置于一定選擇壓力之下的選擇方法。 選擇抗性植株eg：耐鹽、抗除草劑、抗病、抗氨基酸突變體等第三十四張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月間接選擇：利用細胞內(nèi)反應(yīng)，形成某種有毒物質(zhì)使野生型被淘汰，從而選出突變體eg：硝酸還原酶突變株在氯酸鹽培養(yǎng)基上，具有硝酸還原酶活性的野生型細胞將被殺死，而突變株可以存活。第三十五張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月小麥耐鹽細胞突變體篩選1.小麥穗（花粉發(fā)育到單核晚期）射線輻照誘變。2.取花藥接種在N6+2,4-D2.0+KT0.5+NaCl0.3上誘導(dǎo)愈傷組織。3.在去鹽培養(yǎng)基上，將上述愈傷組織繼代13次。4.移愈傷組織至N6+NAA1.0+KT1.0+NaCl0.3上分化成苗。5.將再生植株移栽到鹽漬土中，檢測其耐鹽性。對耐鹽好的植株以秋水仙素處理，使染色體加倍。6.對入選株后代進行耐鹽穩(wěn)定性測定、遺傳分析及育種應(yīng)用。第三十六張，PPT共三十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）