開題報告任務(wù)書

1、寧波大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計()任務(wù)書課題名稱紫菜無菌培養(yǎng)體系的建立與觀察指導(dǎo)教師楊銳學(xué)院生命學(xué)院專 業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖班 級08 水產(chǎn)學(xué)生張小艷學(xué) 號084775734開題日期2011.3.24一、主要任務(wù)與目標(biāo)：本實驗通過紫菜對抗生素的耐受性試驗及其外生菌對抗生素的敏感性測試（ 藥敏測試），選擇合適抗生素種類和濃度，并采用抗生素單用及合用方法，篩選最佳除菌抗生素組合并多次進(jìn)行微生物培養(yǎng)基檢測，熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察，為紫菜無菌培養(yǎng)系的構(gòu)建提供方法，為研究藻菌互作提供實驗材料。二、主要內(nèi)容與基本要求：1.1 紫菜樣品和預(yù)處理本研究選用的壇紫菜葉狀體為溫州敖江栽培品種， 于 2011 年 3 月，晾干

2、后，-20冰箱密封保存。紫菜培養(yǎng)液為加入號營養(yǎng)母液（ 100g/L KNO3、10g/L KH2PO4、2.5g/L FeSO4、0.25g/L MnSO4 和 20g/L EDTA-Na2，按營養(yǎng)母液：海水 1： 1000） 的滅菌海水（ 滅菌海水需經(jīng)高壓濕熱滅菌， 號營養(yǎng)母液經(jīng) 0.22m 微孔濾膜過濾除菌）。將好的紫菜葉片打成直徑 6mm圓片， 用 0.7% KI 浸泡 10min， 再經(jīng)滅菌海水3 遍， 備用。紫菜葉狀體微生物的排除紫菜葉狀體對抗生素的耐受性試驗將氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、新霉素、慶大霉素及卡那霉素以 10， 100， 300，500，1000g/mL 的終濃度分別加入

3、300mL 待除菌紫菜培養(yǎng)液中。不同抗生素濃度做 3 個平行，以未加抗生素的紫菜葉狀體為對照，培養(yǎng) 2 天后換培養(yǎng)液， 并追加抗生素。觀察紫菜生長狀況， 6 天后進(jìn)行無菌檢測， 包括微生物培養(yǎng)基檢測， 熒光顯微鏡及掃描電子顯微鏡觀察， 選擇最佳抗生素及濃度。組合抗生素排除紫菜附生菌選擇合適抗生素以最佳濃度 組合處理紫菜圓片 18-20h，用無菌海水 紫菜圓片 3 次， 轉(zhuǎn)入紫菜培養(yǎng)液培養(yǎng) 3h 后更換新鮮培養(yǎng)液， 以徹底去除殘留抗生素，再次轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 6 天，觀察紫菜生長狀況，期間更換培養(yǎng)液 2-3次， 每次處理后均進(jìn)行無菌檢測。無菌檢測培養(yǎng)基檢測法取已排除抗生素影響的紫菜培養(yǎng)液 0.

4、1mL，涂布 2216E 平板和 PDA 平板，分別以36培養(yǎng) 2 天、29培養(yǎng) 5 天，每組做 3 個平行，觀察有無菌落出現(xiàn)。熒光和掃描電子顯微鏡檢測熒光顯微鏡觀察： 將待檢測紫菜圓片用 0.22 m 微孔濾膜過濾的 0.1%（ v/w） 吖啶橙溶液染色 10min 后， 用熒光顯微鏡（ Olympus 公司， 型號 BX-60） 觀察。根據(jù)熒光顏 別菌體與紫菜細(xì)胞（ 紫菜活細(xì)胞發(fā)紅色熒光而細(xì)菌發(fā)綠色到橙色熒光）。掃描電子顯微鏡觀察：取已排除抗生素影響和 處理的紫菜圓片，切成 1mm2的方塊， 經(jīng) 、化學(xué)固定、干燥、噴鍍金屬及 日立公司型號 S-3400N 的掃描電子顯微鏡拍攝， 觀察有無微

5、生物附著.4 抗生素的選擇通過紫菜的生長狀況及無菌檢測的結(jié)果選擇最適合的抗生素。三、計劃進(jìn)度：2010.3.052010.5.30，提出選題的初步設(shè)想，確定選題，查閱文獻(xiàn)。2010.5.302010.8.30，進(jìn)行試驗前的準(zhǔn)備，熟悉實驗中相關(guān)的基本操作。2011.2.182011.3.24，進(jìn)行預(yù)實驗，在指導(dǎo)教師下達(dá)任務(wù)書，完成文獻(xiàn)綜述、開題，學(xué)院組織開題答辯。2011.3.252011.4.24，構(gòu)思框架，完成提綱。2011.7.202011.9.30，在重復(fù)一次實驗，完成實驗的數(shù)據(jù)及圖表的整理。2011.4.252012.2.28，撰寫初稿，送交指導(dǎo)教師。2012.3.012012.4.1

6、9，修改、定稿、印刷。2012.4.202012.4.29， 完成的后續(xù)工作，做好答辯準(zhǔn)備工作。2012.4.302012.5.15，答辯。四、主要參考文獻(xiàn)：方文雅,楊銳,朱鵬等.紫菜外生細(xì)菌抑菌活性及其多聚酮合酶(PKSI)篩選J.微生物學(xué)報,2009,49(2):153160.劉必謙,曾慶國,等.壇紫菜體細(xì)胞單克隆葉狀體途徑及海上養(yǎng)殖J.水產(chǎn)學(xué)報,2004,28(4):407411.馬家海,林秋生,閔建等.條斑紫菜擬油壺菌病的初步研究J.水產(chǎn)學(xué)報,2007,31(6):860864.蘇秀榕,秦松,等.浙江沿海藻類共生細(xì)菌的生理生化特性研究J.生態(tài)環(huán)境,2005,14(2):239241.賁

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