低產(chǎn)高級醇工業(yè)上面發(fā)酵酵母的選育

1、PAGE PAGE - 5 -低產(chǎn)高級醇工業(yè)上面發(fā)酵酵母的選育啤酒是以酒花和麥芽汁為原料,由啤酒酵母釀制而成的酒精飲料1。酵母代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)決定了啤酒的感官特性。根據(jù)風(fēng)味物質(zhì)的化學(xué)屬性,可將其分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、內(nèi)酯類化合物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物、硫化物等2-3。其中,高級醇是指3個或3個以上碳原子的醇類的統(tǒng)稱,同時也稱為雜醇油1,是啤酒中重要的風(fēng)味物質(zhì),主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇4-5。啤酒中高級醇的含量一般為70100 mg/L,而優(yōu)質(zhì)啤酒對高級醇含量的控制更為嚴(yán)格,通常在5090 mg/L6。適量的高級醇能賦予啤酒

2、獨特的香味,含量過低,酒體不豐滿,口感較差;但含量過高時,不僅會影響酒體的協(xié)調(diào)性,還會對飲用者的身體產(chǎn)生明顯的副作用7-9。啤酒高級醇含量過高是業(yè)內(nèi)普遍存在的問題,如何將高級醇含量控制在合理范圍對于提升啤酒品質(zhì)具有重要的意義。目前,高級醇的調(diào)控主要有兩種手段：一是通過原輔料、發(fā)酵溫度、溶氧量等指標(biāo)調(diào)控來優(yōu)化發(fā)酵工藝；二是從發(fā)酵菌種出發(fā),通過選育低產(chǎn)高級醇的優(yōu)良酵母菌株從根本上降低高級醇含量。近年來,隨著對誘變技術(shù)的深入研究,由清華大學(xué)邢新會研究團(tuán)隊自主研發(fā)的常壓和室溫等離子(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術(shù)已經(jīng)成為了一種新型的育

3、種方法。與傳統(tǒng)的誘變技術(shù)相比,此項技術(shù)具有操作簡便、安全性高、高通量誘變、高總突變率和正向突變率高的特點10,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、真菌、微藻等多種微生物的改造11-15。篩選過程是選育低產(chǎn)高級醇酵母菌株的關(guān)鍵限速步驟。傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵篩選方法雖然準(zhǔn)確度較高,但操作繁瑣、周期長、工作量大,無法做到菌株的快速篩選16。近年來,高通量篩選得到了快速發(fā)展。研究表明,分光光度法可以實現(xiàn)高級醇含量的快速檢測17。此外,微孔板的高通量篩選技術(shù)在菌株篩選方面也取得了良好的效果,提高了篩選效率18-19。這些均為低產(chǎn)高級醇酵母菌株的高通量篩選提供了新的策略。本研究以工業(yè)酵母(Saccharomycescerevi

4、siae)680bg為出發(fā)菌株,利用ARTP誘變技術(shù)對其菌懸液進(jìn)行處理,運(yùn)用微孔板培養(yǎng)法結(jié)合分光光度法,建立高通量篩選方法,以期篩選低產(chǎn)高級醇菌株,為啤酒酵母的選育提供依據(jù)。2.4 誘變菌株復(fù)篩由于比色法只能粗略地檢測高級醇的含量,且此法受溫度等因素的影響較大,難免會產(chǎn)生一定的偏差,為了更加精確地篩選出低產(chǎn)高級醇菌株,需要對51株初篩菌株與出發(fā)菌株680bg進(jìn)行發(fā)酵驗證。2.4.1 高級醇含量比較采用1.2.2介紹的發(fā)酵工藝培養(yǎng)菌株7 d,取發(fā)酵液離心、蒸餾,用氣相色譜技術(shù)檢測誘變菌株與出發(fā)菌株高級醇含量。結(jié)果如表1所示,經(jīng)過誘變、反復(fù)篩選,共得到了8株低產(chǎn)高級醇菌株,其中,ARTP-162菌

5、株產(chǎn)生的高級醇含量是所有菌株中最低的,與出發(fā)菌株相比降低了約21%,其他的誘變菌株(ARTP-5、ARTP-12、ARTP-32、ARTP-65、ARTP-109、ARTP-113、ARTP-129)的高級醇含量也較出發(fā)菌株分別降低了14.3%、12%、11.25%、9.9%、12.1%、12.8%、11.1%。表1 誘變菌株與出發(fā)菌株高級醇含量 單位：mg/LTable 1 Comparison of higher alcohol contents between mutated strain and the original strain2.4.2 基本理化指標(biāo)比較待發(fā)酵結(jié)束后,對所有菌株

6、的酒精度、真正發(fā)酵度及發(fā)酵力等理化指標(biāo)進(jìn)行測定、分析。如表2所示,與出發(fā)菌株680bg相比,誘變菌株無論是在CO2釋放量、酒精度還是真正發(fā)酵度上,均沒有發(fā)生明顯的變化。這意味著這些誘變菌株不僅具有低產(chǎn)高級醇的特性還保留了良好的發(fā)酵性能。表2 出發(fā)菌株680bg及誘變菌株的基本發(fā)酵性能Table 2 Fermentation performances of original strain 680bg and mutated strain2.5 誘變菌株遺產(chǎn)穩(wěn)定性檢測通過連續(xù)傳代實驗,對菌株ARTP-162的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。如圖5所示,隨著傳代次數(shù)的增加,誘變菌株ARTP-162的產(chǎn)高級醇能力、酒精度、真正發(fā)酵度及CO2生成量等基本發(fā)酵性能并沒有發(fā)生大變化,直至第八代也基本維持穩(wěn)定,這表明誘變菌株ARTP-162遺傳性能穩(wěn)定,可用于工業(yè)化生產(chǎn)。a-傳代次數(shù)對菌株高級醇產(chǎn)量的影響；b-傳代次數(shù)對菌株酒度、發(fā)酵度及總失重的影響圖5 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.5 Analysis of genetic stability of mutagenic strain3 結(jié)論ARTP離子誘變是一種新型有效的誘變育種方法。本研究以菌株680bg為出發(fā)菌株,運(yùn)用ARTP離子誘變手段對其進(jìn)行誘變處理,經(jīng)48孔板培養(yǎng)后用高級醇分光光度法快速檢測菌株的高