復旦大學微生物學課件13-微生物分類

1、第十章 微生物的分類和鑒定1分類學（Taxonomy）源自希臘語的 taxis (“arrangement”排列) and nomos (“l(fā)aw”法規(guī))Classification (分類）: 由具體到抽象-收集大量描述有關(guān)個體的文獻資料，整理成科學的分類系統(tǒng)Identification（鑒定）:從抽象到具體-將未識別的生物歸類為某一確定分類單元的行為和結(jié)果 Nomenclature（命名）: 對每個新的類型微生物進行命名的過程Taxonomy （分類學） is an agreement among people 2分類相關(guān)數(shù)據(jù)庫1）NCBI數(shù)據(jù)庫：/Taxonomy 優(yōu)點：對序列進行比較分

2、析 缺點：有很多錯誤的分類信息2）RDP數(shù)據(jù)庫： （適用于群落結(jié)構(gòu)分析） 優(yōu)點1：從NCBI取出16S rRNA基因序列后，通過分析確認其分類信息 優(yōu)點2：對很多（幾百條）序列確定分類信息 3）LPSN數(shù)據(jù)庫： http:/www.bacterio.cict.fr/ 優(yōu)點：嚴格按照分類規(guī)則建立，能了解不同層次分類（包括典型菌株信息） 缺點：不能比較測序結(jié)果，不能進行分類鑒定4） EzTaxon： 優(yōu)點：包括典型菌株信息，也能比較測序結(jié)果，可以進行分類鑒定5）Bergey氏原核生物分類系統(tǒng)：不僅是序列信息，形態(tài)學、生化信息全3第一節(jié) 通用分類單元Category （taxon, 分類單位）Dom

3、ain （域） - Phylum，Division（門） - Class （綱） - Order （目） - Family (科） - Genus (屬） - species (種） （4各級分類單元FungiEukaryaAscomycotaHemiascomycetesSaccharomycetalesSaccharomycetaceaeSaccharomycesS. cerevisiaeBakers yeastSpeciesGenusFamilyOrderClassPhylumKingdomDomainAll organismsM. okinawensisMethanothermococ

4、cusMethanococcaceaeMethanococcalesMethanococciEuryarcheotaNone assigned for archaeaArchaeaMethanococcusE. coliE. coliEscherichiaEnterobacteriaceaeEnterobacterialesGammaproteobacteriaProteobacteriaNone assigned for bacteriaBacteria門域綱目科屬種界5種（species）的概念 微生物的種（species，簡寫sp.，又譯物種）是一個基本分類單元，它是一大群表型特征高度相

5、似、親緣關(guān)系極其接近、與同屬內(nèi)其他物種有明顯差異的菌株的總稱。6具有該種的許多典型性狀的模式菌株才是具體的“種”。 菌株又稱品系（在非細胞型的病毒中則稱毒株或株），表示任何由一個獨立分離的單細胞（或單個病毒粒子）繁殖而成的純遺傳型群體及其一切后代。菌株（strain）菌株 (strain) = 純培養(yǎng)物 (pure culture) = 克隆 (clone)典型菌株（type strain）-或模式種 一個種的具體代表，稱為典型菌株。具有該種的許多典型性狀。注意：典型菌株一般由兩個以上國家的菌種保藏機構(gòu)保藏，以便備查考、索取和購買。7sp. vs spp.Bacillus sp. （一種芽孢桿

6、菌）Bacillus spp. (若干種芽孢桿菌）Strain (菌株)Escherichia coli K12Type strain (典型菌株） Rhizobium daejeanense L61T 8雙名法（binominal nomenclature）雙名法屬名（generic name）種名加詞（specific epithet）9微生物命名 （拉丁文）例: Escherichia coli, E. coli, Escherichia sp. K12， Escherichia sp.，Escherichia spp.,and“the genus Escherichia”屬名可用縮寫，

7、但種名不能縮寫屬名可以單獨用，但種名必須與屬名一起用屬名和種名必須要用斜體，當手寫時需用下劃線文章中第一次用學名時需要用全稱，第二次開始屬名可以用縮寫（但必須與種名一起用）。如果用縮寫后可能與其它屬引起混淆，就不能用縮寫。Escherichia coli K12屬名種名菌株名10俗名（common name） 指普通的、通俗的、地區(qū)性的名字，具有大眾化和簡明的優(yōu)點，但往往涵義不夠確切，易于重復，使用范圍局限。例如，“結(jié)核桿菌” 是Mycobacterium tuberculosis （結(jié)核分枝桿菌）的俗名; “紅色面包霉”是Neurospora crassa（粗糙脈孢菌） 的俗名。 11學名和

8、俗名比較12命名法（Nomenclature）Approved List of Bacterial Name (International Journal of Systematic Bacteriology 1980, 30:255-429)在 Approved List之前，沒有固定的規(guī)律來描述新的種e.g., 鏈霉菌（Streptomyces ）屬曾同時包含超過3,000 種 統(tǒng)一的系統(tǒng) 理事會：International committee on systematic bacteriology (ICSB) （系統(tǒng)細菌學國際委員會）規(guī)則：細菌命名法的國際法規(guī)官方雜志Internatio

9、nal Journal of Systematic Bacteriology （IJSB）International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology （IJSEM） (From 2000)13微生物命名（Nomenclature）流程 分類學的提議(新的分類單位，新的組合)IJSEM中發(fā)表其它雜志發(fā)表Notification Listin IJSEMValidation List in IJSEM作者委托 IJSEM14Candidatus（候選的）沒有純培養(yǎng)通過有限的信息描述16S rDNAMorphology（形態(tài)學）

10、 (熒光原位雜交后 TEM, SEM)Ecology（生態(tài)學-生存環(huán)境、生長條件）其它信息（全基因組分析等）15厭氧氨氧化的2個新種-16sRNA，原位雜交后電鏡觀察可見其形狀、大小16第二節(jié) 微生物在生物界的地位一、生物的界級分類學說三域17現(xiàn)在： 三域+ 病毒域二、三域?qū)W說及其發(fā)展 三域?qū)W說是70年代末由C.R. Woese對大量微生物和其他生物進行16S和18S rRNA的寡核苷酸檢測，并比較其同源性水平后提出的。域：一個比界更高的界級分類單元。細菌域古生菌域真核生物域18BacteriaEukaryaArchaeaProkaryotesEukaryotesMacroorganisms三

11、域?qū)W說19三域?qū)W說及其生物進化譜系樹20Nature, 2013,Dec. 1221廣古生菌泉古生菌真核生物產(chǎn)液菌/產(chǎn)氫菌綠色非硫化細菌異常球菌螺旋體綠色硫細菌類桿菌黃桿菌浮霉狀菌衣原體格蘭氏陽性菌藍細菌棲熱孢菌硝化螺旋菌變形菌22細菌域古生菌的主要類群甲烷球菌甲烷棲熱菌甲烷桿菌古生球菌嗜鹽甲烷菌甲烷八疊球菌熱原體甲烷螺菌鹽桿菌鹽球菌甲烷嗜熱菌熱網(wǎng)菌熱變型菌熱球菌硫化葉菌硫還原球菌KorarchaeotaCrenarchaeotaEuryarchaeota廣古生菌泉古生菌古古生菌23古古生菌門泉古生菌門廣古生菌門嗜鹽嗜酸厭氧產(chǎn)甲烷24海洋廣古生菌門海洋泉古生菌門奇古菌門25廣古菌門泉古菌門Be

12、rgey氏原核生物分類系統(tǒng)綱要1. 伯杰氏鑒定細菌學手冊1923年2. 伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊1984年細菌分類鑒定的兩本權(quán)威手冊第三節(jié) 各大類微生物的分類系統(tǒng)剛要261923年第1版1925年第2版1930年第3版1934年第4版1939年第5版1948年第6版1957年第7版1974年第8版1994年第9版1、伯杰氏鑒定細菌學手冊 第9版的伯杰氏細菌鑒定手冊設(shè)立35個群，將古生菌部改編為5個群，全書描寫約500個屬。劃分為四大類：第一類 具細胞壁的革蘭氏陰性細菌 第二類 具細胞壁的革蘭氏陽性細菌 第三類 無細胞壁的細菌 第四類 古生菌 27Bergeys Manual of Determin

13、ative Bacteriology 9th Edition 伯杰氏鑒定細菌學手冊1994年第9版，撰稿人多達300多位，涉及20個國家。鑒定手冊包括35個群細菌。28伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊第1版（1984年）是在伯杰氏鑒定細菌學手冊第8版（1974年）的基礎(chǔ)上，根據(jù)10多年來細菌分類所取得的進展編寫的。系統(tǒng)手冊的新內(nèi)容：G+C mol%、核酸雜交、16 S rRNA寡核苷酸序列等系統(tǒng)發(fā)育方面的資料，特別是許多新的分類單元的劃分，都是經(jīng)過核苷酸序列比較后提出的。2、伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊19841989年第1 版20012012年第2 版29第一卷：一般醫(yī)學和工業(yè)方面重要的革蘭氏陰性細菌。第二卷：

14、放線菌以外的革蘭氏陽性細菌。第三卷：古細菌、藍細菌及其他革蘭氏陰性細菌。第四卷：放線菌。伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊(第1版)30Bergeys Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition ) Springer, New York Volume 1(2001) TheArchaeaand the deeply branching and phototrophicBacteria（古生菌及其分支和光和細菌）Volume 2(2005)TheProteobacteria （變形菌門）Volume 3(2009)TheFirmicutes （厚壁菌門）Vol

15、ime 4 (2011) TheBacteroidetes,Spirochaetes,Tenericutes(Mollicutes),Acidobacteria,Fibrobacteres,Fusobacteria,Dictyoglomi,Gemmatimonadetes,Lentisphaerae,Verrucomicrobia,Chlamydiae, andPlanctomycetes （擬桿菌門等微生物量少的菌）Volume 5(2012)TheActinobacteria （放線細菌門）31真菌界子囊菌門擔子菌門接合菌門壺菌門無性型真菌類子囊菌綱酵母菌綱裂殖酵母綱外囊菌綱新乳霉綱肺囊霉

16、綱擔子菌綱銹菌綱黑粉菌綱接合菌綱毛菌綱目前得到學術(shù)界較廣泛采用的是Ainsworth的分類系統(tǒng)。Ainsworth等人的菌物分類系統(tǒng)綱要第九版（2001）321、基于生理學特征的經(jīng)典鑒定方法：基于少數(shù)的形態(tài)學和生理學的性質(zhì)基于主觀的選擇性（指標）的試驗缺少均一性 (標準化)第四節(jié) 微生物分類鑒定方法332、數(shù)值分類鑒定基于借助于計算機分析大量的表型的性質(zhì)(e.g. 300 strains x 200 tests)更多的分析項目同樣缺乏均一性（選擇的項目仍有主觀性）費力的API 細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) (API system)Biolog細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng) 343、現(xiàn)代分類鑒定方法Committee o

17、n Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics of International Committee on Systematic Bacteriology (ICSB， 細菌系統(tǒng)學國際委員會) - Wayne et al. (1987) IJSB 37:463-464細菌的物種應(yīng)該反應(yīng)基因組的關(guān)系基于直接或間接的測量基因組核苷酸序列的比較基因組測序 (直接的) 理想的，但以前是不切實際DNA-DNA 雜交 (間接的)種的定義在最優(yōu)化的雜交溫度下，全基因組雜交，70結(jié)合（同源性） Tm 小于5度【The phylogenetic d

18、efinition of species generally would include strains with approximately 70% or greater DNA-DNA relatedness and with 5C or less Tm. Both values must be considered. 】 (屬于同一個種的標準：Tm 小于5度，且雜交同源性大于等于70%)35DNA-DNA雜交: 方法間接地評價兩個菌株的基因組的親緣關(guān)系缺點:- 無法鑒別屬以上的水平（定種可以） - 費力（分別提?。?，昂貴- 無法產(chǎn)生數(shù)據(jù)庫36Small subunit rRNA (rDN

19、A)（小亞基核糖體RNA）基因測序 ： 用目標基因代表整個基因組 (rDNA, rpo, gyr)SSU rRNA（ Small subunit ribosome RNA ）優(yōu)點：存在于大多數(shù)物種 (真核生物, 古細菌, 真細菌)便于測序基于保守區(qū)域的PCR (ca. 1,500 nt)基于保守區(qū)域的測序大型數(shù)據(jù)庫 2,000,000 small subunit rDNA sequences 3716S rRNA在結(jié)構(gòu)和功能上的作用3816S rRNA gene 在分子分類學應(yīng)用16S rRNA 所有的細菌都具備的古老的分子 功能恒定 普遍分布 系統(tǒng)發(fā)生距離上中度保守More than 2,0

20、00,000 of 16S rRNA gene sequences are currently available on RDP.39ProcaryoteEukaryoteOveral size70S80SSmall subunit30S40S Number of proteins2130 RNA size (number of base)16S(1500bp)18S(2300bp)Large subunit50S60S Number of proteins3450 RNA size (number of base)23S (2900bp)5S (120bp)28S (4200bp)5.8S

21、(160bp)5S (120bp)核糖體（Ribozome) structure線粒體和葉綠體的核糖體跟原核生物的核糖體更相似40DNA雜交和16S rRNA基因相似度關(guān)系16S rDNA 序列相似度97時其DNA-DNA雜交值97時不好估計DNA-DNA雜交值。10041分類的方案16S rDNA 測序不同的分支屬水平的鑒定（小于95%)新的屬Genomic species新的種化學的，表型的數(shù)據(jù)的支持Yes現(xiàn)有的物種單元物種： 16S rDNA 相似度A 95%A=97%種內(nèi)DNA-DNA雜交物種： 大于97% 16S rDNA 相似度同源性大于等于70%，同一個種同源性小于70%，不同種

22、（99% 16S rDNA” 或“相同的 GC 含量” 都有可能對應(yīng) “70% 雜交值”)Hybridization value 70% : same species61DNA-DNA 雜交概述基因組 DNA純化靶 DNAs的固定預雜交生物素標記的探針 DNA雜交和酶反應(yīng)檢測62靶 DNAs的固定 Brevibacterium casei DSM 20657T AJ251418 Brevibacterium linens DSM 20425T X77451 Target Brevibacterium iodinum NCDO 613T X76567Probe: strain of interestBrevibacterium aureum Enb15 AY299092Brevibacterium aureum Enb17 AY29909395998391970.01 感興趣的菌株相關(guān)微生物完全無關(guān)的 e.g. E. coli變性(+) control靶(-) control單鏈 DNAs固定到膜上washing洗出未結(jié)合的 DNAs63與鮭魚精DNA預雜交 鮭魚精 DNA 是與細菌 DNA完全無關(guān)的DNA. 充當非特異性的配體 使靶 DNA中未結(jié)合的受體飽和 去除非特異性的 DNA-DNA