蛋白質(zhì)分離純化鑒定2012課件

1、生物大分子的制備核酸蛋白質(zhì)4個堿基結(jié)構(gòu)相似 理化性質(zhì)接近20個氨基酸極性不同奇妙獨特的結(jié)構(gòu)（空間）1蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)單一蛋白質(zhì)全序列分析強調(diào)結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)生物學(xué)復(fù)雜混合物部分序列分析數(shù)據(jù)庫匹配進行蛋白質(zhì)鑒定系統(tǒng)生物學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)2蛋白質(zhì)分離純化及鑒定基本原則基本方法目的: 獲得一定量、高純度的蛋白質(zhì)3化學(xué)結(jié)構(gòu)性 質(zhì)功 能方 法4沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)基本方法檢測技術(shù)依賴于被分離蛋白的特性5沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑、離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳 免疫電泳, 蛋白印跡,毛細(xì)管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技

2、術(shù)、離心濃縮技術(shù)6沉淀技術(shù) 不同的物質(zhì)置入相同溶液，溶解度是不同的。 改變蛋白質(zhì)在水中的穩(wěn)定因素。 從樣品中獲得蛋白成分 蛋白組分初分用途原理7離心技術(shù)細(xì)胞組分的初分亞細(xì)胞組分純化蛋白質(zhì)分離（沉降系數(shù)）10RCF (relative centrifuge field)相對離心場 以重力常數(shù)g的倍數(shù)表示RCF1.11 X 105 X（轉(zhuǎn)數(shù)/分）2 X rrpm ( round per min )(revolution per minute) 原理質(zhì)量 大小 形狀 密度11基本構(gòu)成部件 完備部件12沉降平衡離心沉降速度離心沉降系數(shù)差異，形狀與密度可能相似顆粒密度差異(等密度梯度離心)(區(qū)帶速度離心

3、)密度梯度離心樣品任何組分的密度要大于介質(zhì)梯度密度介質(zhì)最大密度大于樣品組分的最大密度16Cell separationsSubcellular particlesVirusesProtein separationsRate Zonal Centrifugation沉降速度離心17Zonal Centrifugation. The steps are as follows: (A) form a density gradient, (B) layer the sample on top of the gradient, (C) place the tube in a swinging-bucke

4、t rotor and centrifuge it, and (D) collect the samples 18Viral isolationsSubcellular particlesIsopycnic Centrifugation等密度點在離心場能自行形成密度梯度沉降平衡離心19沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳 免疫電泳, 蛋白印跡,毛細(xì)管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)23 色譜（層析）對 多組分復(fù)雜混合物 的 分離、分析（定性與定量） 檢測過程分離過程色 譜色譜是對混合物分離分析的過程,包括分

5、離技術(shù)和檢測技術(shù)24色譜過程固定相(+擔(dān)體)流動相樣品差速遷移柱色譜25平面色譜26混合物在固定相和流動相中分配原理不同固體、液體或柱、平面氣體、液體、超臨界流體吸附，分配，離子交換，排阻，親和液固氣固正相反相滲透過濾27 色譜分類方法超臨界流體色譜法 SFC氣相色譜法 GC液相色譜法 LC離子交換色譜法分配色譜法吸附色譜法排阻色譜法(分子篩）親和色譜法紙色譜法薄層色譜法柱色譜法平面色譜法常壓高壓(高效)28色譜分離機理離子交換色譜固定相離子交換樹脂產(chǎn)生差速遷移的基礎(chǔ)離子交換能力的不同離子交換樹脂的 可交換離子 與流動相中組分離子發(fā)生 交換反應(yīng)也是 組分離子 與 流動相內(nèi)的離子 對固定相上離子

6、競爭交換的過程 適宜于分離相對分子量20000的蛋白質(zhì)，可以保持蛋白質(zhì)等生物大分子的天然構(gòu)象和生物活性2930色譜分離機理排阻色譜固定相凝膠產(chǎn)生差速遷移的基礎(chǔ)分子的大小、形狀應(yīng)用范圍 測定蛋白分子量 更換蛋白的緩沖溶液 脫鹽 純化回收問題活性測定是小分子的去除3134色譜洗脫方式等度洗脫線形梯度洗脫分步洗脫自始至終用一種洗脫液洗脫液可以是幾種充分，以一定規(guī)律改變其濃度，或pH，或離子強度等不同洗脫液更換35柱色譜中使用的檢測方法 UV280 生物活性檢測器UV熒光電化學(xué)電導(dǎo)36平面色譜中使用的檢測方法顯色試劑熒光紫外37Protein purification by chromatograph

7、y色譜圖洗脫曲線38HPLC簡單介紹泵色譜柱（多種類型）檢測器（多種類型）數(shù)據(jù)采集進樣器柱溫箱39LCMS色質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜儀多維液相色譜分離 蛋白質(zhì)組學(xué)色譜技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究40雙向凝膠電泳非凝膠技術(shù) 局限性 （1）低豐度蛋白和膜蛋白的檢測 （2）堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測（3）分子量大小的限制（4）重復(fù)性問題 （5）有限的動態(tài)范圍 （6）自動化問題 一維和多維的非凝膠技術(shù) 高效、快速、自動化程度高、靈敏度高 檢測限(100kDa、10 kDa) 二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式 離子交換色譜/凝膠過濾色譜反相色譜 41二維凝膠電泳多維色譜-MS凝膠圖像分析酶解酶解樣品（組織、細(xì)胞等）二維數(shù)據(jù)庫數(shù)

8、據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)鑒定肽混合物肽階梯序列肽指紋譜肽序列標(biāo)簽MS 4243沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳 免疫電泳, 蛋白印跡,毛細(xì)管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)44電泳技術(shù)原理用途45除了電荷作用，同時具有分子篩作用46SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS) 消除了原攜帶電荷的差別，遷移僅與分子量有關(guān)47Electrophoresis Can Determine Mass. The electrophoretic mobility of many pr

9、oteins in SDS-polyacrylamide gels is inversely proportional to the logarithm of their mass. 48The gel is stained with Coomassie blue. The positions of some of the major proteins in the gel are indicated in the drawing. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis pattern of the proteins in the human red b

10、lood cell membrane. 491-450Two-dimensional gel electrophoresis, a technique for separating proteins based on their charge and their mass. 蛋白質(zhì)組學(xué)51免疫電泳分離與鑒定一次完成52Western blottingIsolation and Identification 蛋白印跡技術(shù)53沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳 免疫電泳, 蛋白印跡,毛細(xì)管電泳離子交換、過濾、親和透析, 超濾, 冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技

11、術(shù)柱、平面、儀器54透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)用途：脫去鹽、小分子、水55冰浴或置入冰箱56透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)用途：進一步分離、樣品濃縮超濾離心過濾管一次性超濾管超 濾 器57透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù) 通過升華從凍結(jié)的生物產(chǎn)品中去掉水份或其他溶劑的過程。冰凍干燥的過程中樣品的結(jié)構(gòu)不被破壞，固體成份被堅冰支持,冰升華時，在干燥的剩余物質(zhì)里留下孔隙，保留了物質(zhì)的生物和化學(xué)結(jié)構(gòu)及其活性的完整性。 58檢測技術(shù)依賴于被分離物的特性59酶活性生物活性免疫學(xué)檢測蛋白質(zhì)定量專一 通用 放射性物質(zhì)60蛋白質(zhì)定量紫外分光光度法 福林酚法（Lowry法） 考馬斯

12、亮藍法 雙縮脲法 線性關(guān)系好快速，檢測限低快速61酶活性如果被分離蛋白是酶如果用粗酶制劑測活性，要考慮去除小分子的物質(zhì)62生物活性如果被分離蛋白有相應(yīng)的配體63免疫學(xué)檢測如果被分離蛋白有相應(yīng)的抗體64ELISA6566Western blot 蛋白印跡技術(shù)67材料的選擇 方案的確立 方案的評價 純度的鑒定 基本原則基本的流程68材料的選擇 有效成分含量多、穩(wěn)定性好； 提取工藝簡單、便于純化； 來源豐富并綜合考慮其它因素； 有綜合利用價值. 磷酸單酯酶在肝、胰、脾豐富，但與磷酸二酯酶共存. 前列腺中含量低，但幾乎沒有磷酸二酯酶.69 方案的確立 純度是否逐漸增加衡量方案是否合適 專一、準(zhǔn)確、靈敏

13、和簡便的生物活性測定方法 光譜法、電化學(xué)法、生物活性檢測法、免疫檢測 純化方案的排布 先粗放、快速、有利于縮小體積 后精確、費時、需樣品量少 切忌在一個純化方案中重復(fù)使用一種分離方法 方法選擇具備充分的理由蛋白質(zhì)的純度一般是指是否含有其它雜蛋白，不包括鹽、緩沖液離子、SDS等小分子。鹽及小分子如何去除?70 方案的評價 在特定實驗中能增大純化倍數(shù)和提高收得率的方法均屬有價值的。 純化倍數(shù)和收得率的要求是根據(jù)材料來源的難易而變化的。71Quantification of a purification protocol for a fictitious proteinStep Total prot

14、ein (mg) Total activity (units)Specific activity, (units mg-1 Yield (%)Purification levelHomogenization 15,000150,000 10100 1Salt fractionation 4,600138,000 30 92 3Ion-exchange chromatography 1,278115,500 90 77 9Molecular exclusion chromatography 68.8 75,000 1,100 50 110Affinity chromatography 1.75

15、52,50030,000 353,000有效成分的總活力兩次比活的比值兩次總活力的比值7273純化方案的設(shè)計與評價74鑒定蛋白純度的方法SDSCEIEFHPLCMS末端分析法 只用一種方法鑒定蛋白純度是不夠的，至少要用兩種以上的方法，而且是不同分離機理的方法。 純度的鑒定 （鑒定方法標(biāo)出）是否含有其它雜蛋白？75 細(xì)胞的破碎 抽提 濃縮（大體積變小體積） 純化 濃縮、凍干、結(jié)晶 基本的流程 76 細(xì)胞的破碎 基本的流程 超聲勻漿凍融酶法化學(xué)處理前期處理77抽提 基本的流程 緩沖溶液對有效成分溶解度大、破壞作用??；對雜質(zhì)不溶或溶解度?。挥绊懸蜃影?pH，金屬離子，溶劑濃度和極性，水解酶, 溫度攪拌, 氧化蔗糖甘油DMSO鹽抑制劑 PMSF調(diào)節(jié)pH改變極性低溫敏感的酶DTTGSHCys巰基乙醇78 濃縮 基本的流程 沉淀吸附法超濾