生物分離考研第9章課件

1、第九章 電泳和電色譜電泳：荷電溶質(zhì)（電解質(zhì)）或粒子在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電泳分離：利用荷電溶質(zhì)在電場中泳動速度的差別進(jìn)行分離的方法電泳色譜：溶質(zhì)的電動遷移和色譜分離作用相結(jié)合的分離方法電色譜：利用電滲作用驅(qū)動流動相流動，分離作用主要為溶質(zhì)在色譜固定相和流動相間的分配。 熱的產(chǎn)生（電泳過程主要問題）： 熱擴(kuò)散、對流、燒膠凝膠電泳 ，自由流電泳 電泳主要用于物質(zhì)的分析和鑒定，也可用于微量樣品的分離純化。分析 分離 9.1 基礎(chǔ)理論9.2 凝膠電泳9.3 等電聚焦9.4 二維電泳9.5 逆向作用色譜電泳9.6 毛細(xì)管電泳和電色譜9.7 連續(xù)電泳和電色譜9.1 基礎(chǔ)理論1. 電泳速度a. 自

2、由溶液中的電泳速度 荷電溶質(zhì)在電場中所受靜電引力f與溶質(zhì)的荷電數(shù)Z和電場強(qiáng)度E成正比： e為電子電量（1.610-19 C） 根據(jù)stokes定律，球形溶質(zhì)在溶液中受的粘性阻力，與速度有關(guān) 為溶液黏度；r為球形溶質(zhì)的半徑；e為溶質(zhì)的運(yùn)動速度當(dāng)電場力與黏性阻力達(dá)到平衡時，溶質(zhì)恒速泳動，其泳動速度為 或 其中 稱為電解質(zhì)的遷移率（mobility），是單位電場強(qiáng)度下的泳動速度。b. 凝膠中的電泳速度 可避免或減小因?qū)α骰驘釘U(kuò)散引起的分離度降低，本身還具有分子篩的作用,電泳速度與分子大小相關(guān)。 常用聚丙烯酰胺凝膠, 其他包括瓊脂糖、淀粉等。 按膠的形狀劃分： 盤狀電泳和板狀電泳。 板狀薄片凝膠散熱好

3、，可提高電泳分辨率，在同一塊膠可跑很多樣品，應(yīng)用比管狀膠廣泛。 按凝膠的組成來劃分，可分為： 連續(xù)凝膠電泳和不連續(xù)凝膠。 不連續(xù)電泳的凝膠由濃縮膠和分離膠組成，二層膠的濃度、離子強(qiáng)度和pH不同，電泳時樣品可在兩層膠間濃縮為很薄一層，可提高電泳分辨率。分離膠濃縮膠樣品 常用的不連續(xù)電泳的電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；樣品緩沖和濃縮膠的緩沖為pH6.8的Tris-HCl緩沖液；分離膠的緩沖為pH8.8的Tris-HCl緩沖液。 電泳開始后，蛋白樣品進(jìn)入濃縮膠，濃縮膠中的Cl- 速度最快，稱為快離子或先導(dǎo)離子；電極緩沖液中的甘氨酸進(jìn)入濃縮膠后，由于濃縮膠為pH6.8，甘氨酸只有很少

4、一部分電離為負(fù)離子，電泳速度最慢，稱為慢離子或隨后離子；蛋白等組分的電泳速度介于二者之間。 電泳時，快離子最快，與后面的蛋白組分間形成低離子強(qiáng)度的低電導(dǎo)區(qū)，低電導(dǎo)區(qū)產(chǎn)生高的電位梯度，促使落后的蛋白離子加速移動，趕上走在前面的蛋白分子，使樣品在快慢離子間壓縮成很薄的一層。 等電聚焦的關(guān)鍵是形成穩(wěn)定的pH梯度。 根據(jù)形成pH梯度介質(zhì)的不同，梯度又分為載體兩性電解質(zhì)梯度(Carrier ampholytes pH gradients)或固定化pH梯度（Immobilized pH gradients）。 載體兩性電解質(zhì)梯度 一般在聚丙烯酰胺凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)形成pH梯度。 載體兩性電解質(zhì)由數(shù)百

5、至數(shù)千種不同的脂肪酸的多氨基多羧酸的異構(gòu)體和同系物組成，它們具有相近但不相同的pKa和pI值，在外電場的作用下，能夠形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)pH梯度，緩沖能力強(qiáng)。 Ampholine （pH46、 pH810、 pH911等 ）固定化pH梯度（Immobilized pH gradients isoelectric focusing，IPGIEF） 所用介質(zhì)為一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺具有相似的聚合行為。 聚合后在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系。 聚合時形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變 IPGIEF比傳統(tǒng)IEF具有更高分辯率，上樣量更大

6、，分辨率可達(dá)0.001pH，為目前分辨率最高的電泳方法之一。 immobiline固相pH梯度穩(wěn)定度高，不漂移，重復(fù)性好，分辨率高9.4 二維電泳 雙向電泳 大都指第一向?yàn)榈入娋劢?載體兩性電解質(zhì)或固相pH梯度)，第二向?yàn)樘荻萐DS電泳。利用電荷和分子尺寸進(jìn)行兩次分離。 第二向電泳前，將等電聚焦膠條或管狀凝膠在SDS溶液中預(yù)先平衡。 處理量小，主要用于蛋白質(zhì)組分析。 溶質(zhì)移動速度是電滲流和電泳的綜合結(jié)果 溶質(zhì)均向陰極移動 毛細(xì)管電泳和電色譜特點(diǎn)：毛細(xì)管內(nèi)徑小，可有效抑制電泳過程中的對流和混合，分離精度高。毛細(xì)管比表面積大，散熱速度快，電場強(qiáng)度可達(dá)100300V/cm, 分離速度快，時間短電滲流驅(qū)動的管內(nèi)流速平推流，可有效降低流速分布不均引起的峰分散，分離精度更高分析樣品僅150nl，所需流動相小于1ml，微量分析 毛細(xì)管電泳處理量小，主要應(yīng)用于分析檢測，也可用于微量制備9.7 連續(xù)電