高脂血癥對孕期大鼠急性胰腺炎的影響

1、高脂血癥對孕期大鼠急性胰腺炎的影響【摘要】目的：討論高脂血癥對孕期大鼠急性胰腺炎(AP)的影響。方法：妊娠大鼠隨機分為實驗組(高脂飼料)和對照組(平衡飼料)，分別喂養(yǎng)16d后，用L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arg)溶液(250g/100g)進展腹腔注射，1h后再次腹腔內(nèi)注射(200g/100g)。計算48h內(nèi)大鼠死亡率，分別于末次注射后0、12、24和48h檢測血清甘油三酯(TG)、淀粉酶(AS)和脂肪酶(LPS)；計算胰腺濕/干重比值；觀察胰腺組織的病理變化并評分，免疫組化SP法檢測胰腺組織Bax表達。結(jié)果：實驗組死亡率8.3%，對照組0.0%。實驗組TG較對照組明顯升高(P0.05)；實驗組AS

2、、LPS峰值分別在24、12h出現(xiàn)，對照組都在24h出現(xiàn)且明顯較實驗組低(P0.05)。在L-Arg末次注射后12、24h，實驗組胰腺濕/干重比值較對照組升高(P0.05)，胰腺水腫出血、炎癥浸潤也較對照組更重，病理評分更高(P0.05)。Bax表達的峰值提早出現(xiàn)，且比對照組高(P0.05)。結(jié)論：高脂血癥能使L-Arg誘導的孕期AP提早出現(xiàn)，在此過程中凋亡基因Bax可能參與誘導胰腺腺泡的凋亡，從而減輕胰腺炎的嚴重程度?！娟P鍵詞】孕期；高脂血癥；急性胰腺炎；精氨酸Abstratbjetive:Tstudytheinfluenefhyperlipeianautepanreatits(AP)fra

3、tsduringpregnany.ethds:SDratsinpregnanyererandlydividedintthetestgrupandthentrlgrup，fedfr16daysseparately.RatsinpregnanyeregivenintraperitnealinjetinithL-argininefr2ties(thefirsttie250g/100g,thesendtie200g/100g)atanintervalfnehur.Afterthelastinjetin,thertalityfratsinpregnanyithin48hursalulated.These

4、rutriglyeride(TG)、seruaylase(AS)、lypase(LPS)frbldsaplesandet/dryratifpanreaseretestedatthepintf0、12、24and48hurs.Thepanreatihistpathlgialsrebasednirspihangesasevaluated.TheexpressinfBaxprtEinasdeterinedbySPiunhistheialtehnique.Results:Afterthelastinjetin,thertalityfthetestgrupas8.3%,but0.0%fthentrlgr

5、up.ThelevelfTGinthetestgrupashigherthanthatfthentrlgrup.AS、LPSinthetestgruppeakedat24-and12-hurindividuallyhileAS、LPSinthentrlgrupbthpeakedat24-hurandlerthanthatfthetestgrupbviusly(P0.05).parediththentrlgrup,theet/dryratifpanreasftestgrupinreasedat12-and24-hur(P0.05).Thepathlgialhangesfpanreasftestg

6、ruperereseriusandthepanreatihistpathlgialsreasalshigher,iththeexpressinftheBaxprteinserius,t.nlusin:L-Arg-indued-APduringpregnanyuldappearaheadfshedulebeasusefhyperlipeia.BaxgeneayntributetainarellapptsisandreduetheseverityfAP.Keyrdspregnany;hyperlipeia；autepanreatitis；L-arginine1材料與方法1.1動物安康性成熟SD大鼠

7、雌性48只(體質(zhì)量180220g)，雄性24只(體質(zhì)量220250g)，均由汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。1.2試劑與儀器L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arg)，分析純級(BBI公司，加拿大)。使用時用體積分數(shù)0.9%的NS配成質(zhì)量分數(shù)20%的L-Arg溶液(pH7.0)。Bax抗體免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程，中國)，盒中抗體為兔抗Bax(Santa-ruz公司，美國)。X9全自動生化分析儀、電熱恒溫枯燥箱、低溫高速離心機(貝克曼公司，美國)，1604型精細電子天平(上海實驗儀器廠，中國)，SPT及IPP圖像采集分析系統(tǒng)(ediaybernetis公司，美國)。1.3方法1.3.1動物分

8、組及模型制備大鼠按雌雄比(21)合籠進展交配，飼養(yǎng)于標準動物房(22)，給予規(guī)律光照(12h12h)，自由飲食。發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為妊娠第1d，并隨機分為實驗組高脂飼料(83的平衡飼料，15的豬油，2的膽固醇)和對照組(平衡飼料)，每組24只。所有大鼠在實驗前禁食12h，自由飲水。兩組分別喂養(yǎng)16d后，用L-Arg溶液先于腹腔內(nèi)注射(250g/100g)，1h后，再次腹腔注射(200g/100g)。1.3.2標本制備兩組分別于末次注射L-Arg溶液后0、12、24和48h各取6只處死(如處死時未發(fā)現(xiàn)大鼠懷孕，不納入實驗)，取門靜脈血，別離血清，-70冰箱保存。同時切取大鼠胰腺組織，一分為二，一局

9、部備于胰腺濕/干比率測定，另一局部用多聚甲醛固定，石蠟包埋，備用于組織病理學檢查及免疫組化檢測。1.4觀察指標1.4.1兩組死亡率觀察兩組在注射后各時間點的死亡情況并計算其死亡率。1.4.2血清TG和淀粉酶(AS)、脂肪酶(LPS)用X9全自動生化分析儀檢測。1.4.3胰腺濕/干重比值兩組大鼠于各時間點處死后，切取的胰腺組織于電子天平上稱重(濕質(zhì)量)；再將切取的胰腺組織于60烘干24h，至質(zhì)量不變?yōu)橹?干質(zhì)量)，計算濕/干重比值。1.4.4胰腺組織Bax表達采用免疫組化SP法，其操作步驟嚴格按SP免疫組化染色試劑盒說明進展，結(jié)果判斷：胰腺細胞胞漿染色呈棕褐色或棕黃色為陽性細胞。免疫組化結(jié)果用S

10、PT及IPP圖像采集分析系統(tǒng)處理，4010視野下觀察采集圖像，Iageprplus4.1版專業(yè)圖像分析軟件處理結(jié)果，以平均光密度值表示Bax表達的相對強度，由病理科醫(yī)生進展雙盲檢驗。1.4.5胰腺組織病理學改變及病理評分(表1)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察其病理改變，并按照Shidt鏡下病理評分標準5由病理科醫(yī)生進展雙盲評分。表1胰腺組織病理評分標準略1.5統(tǒng)計學處理全部數(shù)據(jù)以xs表示，計量資料結(jié)果采用SPSS11.0軟件進展方差分析；組織病理學評級比擬采用秩和檢驗，檢驗水準為=0.05。2結(jié)果2.1兩組死亡情況實驗組12、24h死1只，24、48h死2只，總死亡率8.3%。對照組4

11、8h內(nèi)無死亡。2.2血清TG和AS、LPS的測定結(jié)果在一樣時間點，實驗組比對照組TG明顯升高(P0.05)；實驗組的AS、LPS值分別在24、12h出現(xiàn)，而對照組都在24h出現(xiàn)且明顯比實驗組降低(P0.05，表2)。表2兩組不同時間點TG、AS和LPS的測定結(jié)果略2.3胰腺濕/干重比值結(jié)果在12、24h，實驗組比對照組胰腺濕/干重比值明顯升高(P0.05)，在0、48h略有升高(P0.05，表3)。表3兩組不同時間點胰腺組織濕/干重比值結(jié)果略2.4胰腺組織Bax的檢驗結(jié)果胰腺組織中Bax表達于細胞胞漿，實驗組在12h的平均光密度值最高且比對照組表達明顯升高(P與對照組比1)P0.052)P0.

12、050.05)，而對照組在24h最高，兩組都隨著時間點的推移呈下降趨勢(P0.05，表4)。表4兩組不同時間點胰腺組織Bax的表達結(jié)果略2.5胰腺組織病理評分實驗組0h鏡下見局限胰腺小葉間充血，伴有個別炎癥細胞浸潤，但小葉構(gòu)造完好，無水腫、出血。12h見小葉間明顯充血，局限水腫，炎癥細胞浸潤增多。24h見腺泡張力加大，腺泡細胞內(nèi)大量空泡形成，分隔小葉，伴有點狀壞死和出血，大量炎癥細胞浸潤。48h小葉間及小葉內(nèi)廣泛重度水腫，小葉構(gòu)造彌漫性破壞、喪失，出血嚴重，炎癥細胞彌漫性浸潤。對照組0、12和24h與實驗組比胰腺病理損傷明顯減輕(P0.05),48h有所減輕，但無統(tǒng)計學意義(表5)。光鏡下，兩

13、組胰腺病理示典型的AP(圖1、2,封2)。表5兩組不同時間點胰腺組織病理學評分結(jié)果略3討論妊娠合并AP的發(fā)病率為1/10001/50006，發(fā)病時與同齡女性非妊娠AP相比，其臨床表現(xiàn)和生化指標(AS、LPS等)變化明顯。但妊娠期高脂血癥是引起AP的原因或是結(jié)果目前尚不明確。單純?nèi)焉锲诟咧Y尚缺乏以直接導致AP，但在某些狀況(孕婦年齡較大，初次妊娠，糖尿病，前兆子癇以及TG代謝紊亂)下，這種妊娠期血脂生理性升高可能成為導致AP的病理性因素7。本實驗中，實驗組血清TG明顯升高至正常的3倍左右，說明高脂飼料喂養(yǎng)可以在短時間內(nèi)引起妊娠大鼠TG升高，且較靜脈給藥更符合生理特點。在L-Arg溶液末次注射

14、后0h時，發(fā)現(xiàn)胰腺病理變化只有血管內(nèi)充血、中性粒細胞浸潤，沒有出現(xiàn)細胞水腫等情況，說明單純高脂飲食導致的高脂血癥只能引起胰腺病理的細微改變，尚缺乏引起AP。通常胰腺腺泡細胞的受損是AP的初始病理變化，一定劑量的L-Arg能減少、抑制核酸及蛋白質(zhì)合成，而胰腺腺泡細胞的蛋白質(zhì)合成最為活潑，因此極易受損。本實驗中，對兩組末次注射L-Arg后都發(fā)現(xiàn)胰腺有明顯的炎癥性病理損害，說明L-Arg能成功誘導出大鼠AP。研究發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細胞的凋亡程度與AP的輕重程度成負相關。誘導凋亡可明顯減輕胰腺炎的病情8，其機制可能是胰腺炎發(fā)生后出現(xiàn)的炎癥細胞聚集和炎癥細胞產(chǎn)生導致的瀑布樣效應是影響胰腺病情的主要因素，而腺

15、泡細胞的死亡方式?jīng)Q定了瀑布樣反響的程度，進而影響AP的病情輕重。Bax基因是凋亡調(diào)控基因Bl-2家族成員，當Bax過表達時可促進細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，實驗組在12h的平均光密度值最高，而對照組是在24h最高，說明實驗組的急性炎癥比對照組提早出現(xiàn)，而隨著時間點的推移呈下降趨勢，說明胰腺炎越來越嚴重，這可能與高脂血癥的影響有關。妊娠晚期，合體滋養(yǎng)細胞分泌的胎盤生乳素有顯著的脂肪分解作用，TG將釋放出大量FFA，而FFA可能通過以下3種機制損害腺泡細胞TG在胰腺中被胎盤解毒分解，產(chǎn)生過量的FFA對腺泡細胞的直接損傷；FFA誘發(fā)酸中毒，胰蛋白酶原激活加速；胰腺微循環(huán)障礙，而妊娠時各種內(nèi)分泌激素的分

16、泌、各種細胞因子、炎癥介質(zhì)的釋放更加重了FFA對胰腺毛細血管的損害。本實驗可看出在一樣時間點上實驗組TG值遠比對照組高，且實驗組在024h間隨著時間點的推移，TG逐漸下降，說明TG可能在此過程中由于脂肪分解作用大量釋放出FFA,導致腺泡細胞損害加重。而胰腺腺泡細胞的損害，加重了AS、LPS的釋放，從實驗結(jié)果可見實驗組的AS、LPS峰值都比對照組的提早出現(xiàn)，說明高脂血癥能加速AP的誘發(fā)，且病情更重。本研究中，實驗組相對于對照組的胰腺濕/干重比值在12、24h明顯升高(P0.05)，說明在1224h這個時間段內(nèi)，實驗組胰腺水腫較對照組重，隨著胰腺組織從水腫向壞死開展，在48h時間點兩組的差異并不大。而胰腺病理在0時間點實驗組有血管內(nèi)充血、中性粒細胞浸潤，但沒有出現(xiàn)細胞水腫等情況，而對照組在這時間點根本上無變化；隨著時間點的延續(xù)，胰腺損害程度加劇，在12和24h兩組比擬胰腺病理損傷明顯