蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分離純化課件

1、動(dòng)物科技學(xué)院生物化學(xué)課程組西北農(nóng)林科技大學(xué)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化返回到章第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)具有兩性解離的性質(zhì)。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是指使蛋白質(zhì)所帶電荷為零時(shí)溶液的pH。 將鹽濃度為零時(shí)的等電點(diǎn)，稱(chēng)為等離子點(diǎn)。它是蛋白質(zhì)的特征參數(shù)。等電點(diǎn)的測(cè)定采用等電聚焦電泳。 等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度最小。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)酸堿性質(zhì)分子量膠體性質(zhì)紫外吸收變性作用化學(xué)反應(yīng) (1) (2) (3)12 (4)3 (5) (6)返回到章第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)的分子量化學(xué)組成法SDS法凝膠過(guò)濾法滲透壓法沉降系數(shù)法和沉降平衡法分離純化分

2、析鑒定理化性質(zhì)酸堿性質(zhì)分子量膠體性質(zhì)紫外吸收變性作用化學(xué)反應(yīng) (1) (2) (3)12 (4)3 (5) (6)分離純化分析鑒定理化性質(zhì)酸堿性質(zhì)分子量膠體性質(zhì)紫外吸收變性作用化學(xué)反應(yīng)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀 蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過(guò)半透膜） 穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素有： 水化膜； 同種電荷的互相排斥； 布郎運(yùn)動(dòng) 蛋白質(zhì)的沉淀作用是指改變?nèi)芤旱臈l件，影響蛋白質(zhì)的溶解性，使其從溶液中沉淀出來(lái)。選擇性沉淀蛋白質(zhì)的方法 ：鹽析法: 大量的中性鹽(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl

3、，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。有機(jī)溶劑沉淀法： 破壞水化膜，降低介電常數(shù)，PEG、丙酮、乙醇等重金屬鹽沉淀：pHpI時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+ 等）結(jié)成不溶性沉淀生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀法：pH小于等電時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩帷⒖辔端?、鎢酸。酸類(lèi)：三氯乙酸、磺基水楊酸。加熱變性沉淀。等電點(diǎn)沉淀法 (1) (2) (3)12 (4)3 (5) (6)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)紫外吸收 大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收，使得大多數(shù)

4、蛋白質(zhì)在280nm 附近顯示強(qiáng)的吸收。 利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)酸堿性質(zhì)分子量膠體性質(zhì)紫外吸收變性作用化學(xué)反應(yīng) (1) (2) (3)12 (4)3 (5) (6)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化化學(xué)反應(yīng) 黃色反應(yīng)，由硝酸與氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反應(yīng)生成二硝基苯衍生物而顯黃色。多肽的雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個(gè)以上肽鍵的多肽，具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。這是多肽定量測(cè)定的重要反

5、應(yīng)。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)酸堿性質(zhì)分子量膠體性質(zhì)紫外吸收變性作用化學(xué)反應(yīng) (1) (2) (3)12 (4)3 (5) (6)第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化分離純化蛋白質(zhì)的一般原則 分離和純化蛋白質(zhì)就是要增加制品的純度或比活性。 一般流程為：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存分離純化 電泳 前處理粗分離細(xì)分離生物組織 無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶 解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后蛋白質(zhì)保存凝膠過(guò)濾疏水層析吸附層析1、前處理：將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波處理植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨、 纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶

6、菌酶處理（分解肽聚糖）差速離心法收集細(xì)胞的某一組分 在不同離心力下沉降的細(xì)胞組分如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。2、粗分級(jí)：一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)選擇性沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法熱處理選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細(xì)分級(jí)： 透析除鹽sephdex G-25凝膠過(guò)濾除鹽層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析 電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳 離心法：密度梯度離心4、濃縮與保存濃縮方法：保存方法：晶體保存：結(jié)晶過(guò)程

7、本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。凍干粉保存：溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20-70保存。分析鑒定理化性質(zhì)原則方法 (1) (2)123第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)沉淀鹽溶與鹽析 鹽溶：在較低的鹽濃度下蛋白質(zhì)溶解度增大的現(xiàn)象，稱(chēng)為鹽溶。 鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)表面的雙電層，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱(chēng)為鹽析。 在分離蛋白質(zhì)時(shí)通常利用鹽溶促進(jìn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶液中，然后利用鹽析使蛋白質(zhì)

8、從溶液中沉淀出來(lái)。 常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)原則方法利用差異沉淀電泳層析離心膜分離蛋白質(zhì)沉淀有機(jī)溶劑沉淀 與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，可使蛋白質(zhì)沉淀。 沉淀原理是： 脫水作用； 使水的介電常數(shù)降低，蛋白質(zhì)溶解度降低。 有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀：不同的蛋白質(zhì)對(duì)于不同濃度不同比例有機(jī)溶劑的敏感度不同，所以通過(guò)改變有機(jī)溶劑的比例和濃度可以將不同的蛋白質(zhì)分別沉淀出來(lái)。 有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)時(shí)在低溫下進(jìn)行。 蛋白質(zhì)沉淀等電點(diǎn)沉淀 不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處，凈電荷為零， 溶解度最低。所以通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H值，可以使不同等電點(diǎn)的蛋白

9、質(zhì)分別沉淀出來(lái)。 在蛋白質(zhì)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，通常將溶液的pH調(diào)到期等電點(diǎn)處。 (1) (2)123第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)電泳 在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)電泳。 不同的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)不同，相同pH條件下，分子所的帶電荷不同，且分子大小也不同，故在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不同，據(jù)此可互相分離。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)原則方法利用差異沉淀電泳層析離心膜分離蛋白質(zhì)電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)是一種利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙

10、烯酰胺和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)過(guò)聚合交聯(lián)從而形成的三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)。該電泳具有濃縮效應(yīng)、分離效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 蛋白質(zhì)電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)使用含有一種去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）使蛋白質(zhì)變性。SDS通過(guò)疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側(cè)鏈結(jié)合。所有蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物為橢圓棒，短軸恒定，長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)分子量成比例，使電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量。所以SDS常用來(lái)分析蛋白質(zhì)的純度和大致測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)電泳 等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場(chǎng)的作用下運(yùn)

11、動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測(cè)出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)電泳 雙向電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點(diǎn)不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。 (1) (2)123第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)層析技術(shù) 層析是一種利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離分析的技術(shù)方法。 主要的層析技術(shù)有凝膠過(guò)濾，離子交換層析，吸附層析及親和層析等。 分離純化分析鑒定理化性質(zhì)原則方法利用差異沉淀電泳層析

12、離心膜分離蛋白質(zhì)層析技術(shù)凝膠過(guò)濾： 根據(jù)多孔載體對(duì)不同大小，形狀的蛋白分子的排阻能力不同，導(dǎo)致其在層析柱中滯留的時(shí)間不同，分子從達(dá)到小依次先后排出，從而將各個(gè)組分分開(kāi)的一種層析，又稱(chēng)凝膠過(guò)濾層析。 應(yīng)用：分離蛋白質(zhì)、除鹽、測(cè)蛋白質(zhì)分子量 通常所用的填料為： Sephadex: (交聯(lián)葡聚糖) Bio-gel: (聚丙烯酰胺) 蛋白質(zhì)層析技術(shù)離子交換層析： 根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷與層析載體（離子交換劑）電荷之間的相互作用強(qiáng)弱不同而達(dá)到分離目的。分陽(yáng)離子交換和陰離子交換2 離子交換介質(zhì)：離子交換樹(shù)脂；Sepharose (交聯(lián)葡聚糖)蛋白質(zhì)層析技術(shù)親和層析： 利用蛋白質(zhì)特異性結(jié)合進(jìn)行分離。 載體：Sep

13、harose 4等。 空間臂：常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或氨基己酸。 配基選擇：抗原抗體，酶抑制劑 偶聯(lián)：溴化氰法,環(huán)氧氯丙烷法疏水層析，HPLC (1) (2)123第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)分離中的膜技術(shù) 蛋白質(zhì)是高分子化合物，不能透過(guò)半透膜。將蛋白溶液裝入用半透膜制成的透析袋中，可將蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物除去，這種方法叫透析。 利用超濾膜在壓力下使大分子滯留，而小分子及溶劑濾過(guò)的方法叫超濾。 應(yīng)用：除鹽、濃縮分離純化分析鑒定理化性質(zhì)原則方法利用差異沉淀電泳層析離心膜分離 (1) (2)123第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)的含量測(cè)定 1紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨

14、基酸在280nm 有吸收。 2 Lowry法：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。 3 Bradford法：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料的結(jié)合量。 4 凱氏定氮法 5 雙縮脲法分離純化分析鑒定理化性質(zhì)含量純度活性結(jié)構(gòu)分析 (1) (2) (3)12 (4)3第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)活性測(cè)定 1 激酶：標(biāo)記ATP2 磷酸化酶：定磷 3 利用靶酶活性 4 氧化還原酶 5 ELISA分離純化分析鑒定理化性質(zhì)含量純度活性結(jié)構(gòu)分析 (1) (2) (3)12 (4)3第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 第一步：測(cè)定

15、每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比。分離純化分析鑒定理化性質(zhì)含量純度活性結(jié)構(gòu)分析一級(jí)空間 (1) (2) (3)12 (4)3第四節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其分離純化蛋白質(zhì)空間構(gòu)象分析 （1）紫外光譜法 （2）熒光光譜法 （3）園二色性法 （4）紅外光譜法 （5）激光拉曼光譜法 （6）X射線(xiàn)衍射法 （7）核磁共振法分離純化分析鑒定理化性質(zhì)含量純度活性結(jié)構(gòu)分析一級(jí)空間 (1) (2) (3)12 (4)3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定自從1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)以來(lái)，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。 現(xiàn)在一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法已經(jīng)有了很大的改進(jìn)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)完全自自

16、動(dòng)化。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定概況蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 是研究高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。 闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 為生物進(jìn)化理論提供依據(jù) 為人工合成蛋白質(zhì)提供參考順序。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的意義蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（1）樣品必需純（97%以上）；（2）知道蛋白質(zhì)的分子量；（3）知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成；（4）測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)；（5）測(cè)定水解液中的氨量，計(jì)算酰胺的含量。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的要求蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(2)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(3)二硫鍵的斷裂

17、可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。或者用甲酸氧化法將二硫鍵氧化。保護(hù)巰基。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端。 多肽鏈端基氨基酸分為兩類(lèi)：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定末端基氨基酸測(cè)定Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP

18、-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。 二硝基氟苯（DNFB）法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定末端基氨基酸測(cè)定在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光性質(zhì)，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到110-9mol。 丹磺酰氯法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟末端基氨基酸測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。 肼解法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定末端基氨基酸測(cè)定 氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。氨肽酶法一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定末端基氨基酸測(cè)定 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)的水解。根基不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。 目前常用的羧肽酶有四種：A,