PCR的定義、歷史與運用

1、HYPERLINK N:整理后.N:整理后.HYPERLINK N:整理后. t _parent更多資料請訪問.HYPERLINK E:還未拷貝企業(yè)治理治理知識(http:.)(.)HYPERLINK N:整理后.N:整理后.更多企業(yè)學(xué)院：HYPERLINK N:整理后.Shop./Shop/中小企業(yè)治理全能版183套講座+89700份資料HYPERLINK N:整理后.Shop40.shtml t _blank./Shop/40.shtml總經(jīng)理、高層治理49套講座+16388份資料HYPERLINK N:整理后.Shop38.shtml t _blank./Shop/38.shtml中層治

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3、HYPERLINK N:整理后.Shop42.shtml t _blank./Shop/42.shtml工廠生產(chǎn)治理學(xué)院52套講座+ 13920份資料HYPERLINK N:整理后.Shop43.shtml t _blank./Shop/43.shtml財務(wù)治理學(xué)院53套講座+ 17945份資料HYPERLINK N:整理后.Shop45.shtml t _blank./Shop/45.shtml銷售經(jīng)理學(xué)院56套講座+ 14350份資料HYPERLINK N:整理后.Shop46.shtml t _blank./Shop/46.shtml銷售人員培訓(xùn)學(xué)院72套講座+ 4879份資料HYPER

4、LINK N:整理后.Shop47.shtml t _blank./Shop/47.shtml何謂PCR 簡單的講，PCR確實是利用DNAHYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-473.html t _blank聚合酶對特定基因做體外或HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-952.html t _blank試管內(nèi)(InVitro)的大量合成。差不多上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制.目前常用的技術(shù),能夠?qū)⒁欢位驈?fù)制為原來的一百億至一千億倍。 PCR的要素 差不多的PCR須具備.要被復(fù)制的DNA模板(Template).

5、界定復(fù)制范圍兩端的引物(Primers).DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水。PCR反應(yīng)包括三個要緊步驟，分不是 1).Denaturation2).Annealingofprimers,and3).Extensionofprimers。所謂Denaturing乃是將DNA加熱變性，將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板.而Annealing則是令Primers于一定的溫度下附著于模板DNA兩端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下進(jìn)行引物的延長(Extensionofprimers)及另一股的合成。PCR的歷史 PCR的進(jìn)

6、展能夠講是從DNA合成酵素的發(fā)覺緣起。DNA合成酵素最早于1955年發(fā)覺(DNApolymeraseI),而較具有實驗價值及可得性的 KlenowfragmentofE.Coli則是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所發(fā)覺,但由于那個酵素是一種易被熱所破壞之酵素,因此不符合一連串的高溫連鎖反應(yīng)所需?，F(xiàn)今所使用的酵素(簡稱Taqpolymerase),則是于1976年從熱泉Hotspring中的細(xì)菌(ThermusAquaticus)分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個專門理想的酵素，但它被廣泛運用則于80年代之后。PCR的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制(DNArepairrepli

7、cation)，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發(fā)表第一個單純且短暫性基因復(fù)制(類似PCR前兩個周期反應(yīng))的實驗。而現(xiàn)今所進(jìn)展出來的PCR則于1983由Dr.KaryB.Mullis進(jìn)展出的，Dr.Mullis當(dāng)年服務(wù)于一家物科技研究公司(Perkin- ElmerCetusCorporation).目前這家公司在PCR的相關(guān)儀器及原料上占有專門大的巿場。Dr.Mullis并于1985年與Saiki等人正式表了第一篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量能夠講是令眾多其它研究方法難望其項背。在1989年，Science將PCR中的DNA合成酵素命名為當(dāng)

8、年的風(fēng)云分子(Moleculeoftheyear)，而PCR本身則列為年度的重要科學(xué)發(fā)明產(chǎn)物。因此，它的原發(fā)明者更在往后獲得諾貝爾的桂冠。 阻礙PCR的因素 PCR是特不直接、簡單又具有強(qiáng)大威力的技術(shù)。誠如一位當(dāng)年參與PCR誕生的資深研究員HenryErlich所言”在分子生物學(xué)的領(lǐng)域中，只要擁有它，你便能夠無照營業(yè)” (PCRallowspeopletopracticemolecularbiologywithoutaliscence)。也因此，活用及慎用PCR是確保一定品質(zhì)的必要條件。PCR本身盡管是一個單純的實驗技術(shù)，然而一個好的PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物則是受到專門多因素的阻礙。這些因素色括反應(yīng)

9、中各種原料的濃度(Taq.Polymerase,primers,dNTPs,MgCl2)，也包括整個反應(yīng)中各步驟的溫度與時刻的設(shè)定。因此DNA模板(Template)與引信(Primers)本身條件也占有一定的重要性。近來的觀念中，共溶劑諸如Dimethylsulfoxide(DSMO)、glycerol、 ForamideandTetramethylammoniumchloride(TMAC)也對整個反應(yīng)產(chǎn)生若干重要的阻礙。 PCR的運用 PCR除了是一個診斷工具外，更重要的是它有廣泛的運用。PCR本身可直接用來鑒定特定基因的存在與否，也能夠用來偵測基因是否有異常(Genemutation,

10、deletion,andrearrangement)。例如，在醫(yī)學(xué)上對遺傳疾病或腫瘤癌癥的診斷及預(yù)后的評估；對細(xì)菌、病毒及霉菌感染的診斷。它也可成為一個生產(chǎn)線進(jìn)而大量復(fù)制特定的基因進(jìn)行基因密碼的讀取(DNAsequencing)及其它的運用。舉凡對生物標(biāo)本及法醫(yī)學(xué)上的樣本鑒定，從單一毛發(fā)、一只精蟲或一滴血液、唾液來找出兇手。也能夠做DNA指紋(Fingerprints)比對關(guān)心親子關(guān)系的鑒定。PCR更能夠用于器官移植組織兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，經(jīng)由PCR的運用也產(chǎn)生重大的進(jìn)展。近來，在生物醫(yī)學(xué)的研究上，特不是細(xì)胞間訊息的傳遞分子，諸如介白質(zhì)(Interleukines)及各種H

11、YPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-641.html t _blank生長因子(Growthfactors)基因的表現(xiàn)都可用 PCR來進(jìn)行質(zhì)與量的分析。 PCR污染及解決對策PCR檢測微量感染因子時，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題。 一污染的預(yù)防 進(jìn)行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。 （一）劃分操作區(qū)：目前，一般PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但不管是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行： 1.標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板

12、的制備； 2.PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增； 3.產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。 切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-347.html t _blank超凈工作臺或負(fù)壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-925.html t _blank吸頭需固定放于其

13、中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA： 1PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水； 2引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制； 3引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標(biāo)明時刻，以備發(fā)生污染時查找緣故。 (三)實驗操作注意事項盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的緣故，樣品間的交叉污染也是緣故之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是慎重認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1.戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2.使用一次性HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-925.html t _blank吸頭，嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分

14、析室的吸頭混用，吸頭不要長時刻暴露于空氣中，幸免氣溶膠的污染； 3.幸免反應(yīng)液飛濺，打開HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-958.html t _blank反應(yīng)管時為幸免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)趕忙更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4.操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，如此即能夠減少操作，幸免污染，又能夠增加反應(yīng)的精確度； 5.最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-958.html t _blank反應(yīng)管； 6.操

15、作時設(shè)立陰陽性對比和空白對比，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又能夠協(xié)助推斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種專門的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 8.重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。 二追蹤污染源 假如不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條動身，逐一分析，排除污染。 （一）設(shè)立陰陽性對比：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對比時，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對比可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反

16、而可能成為潛在的污染源。假如以含靶序列的重組質(zhì)粒為對比，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對比的選擇亦要慎重，因為PCR敏感性極高，能夠從其它方法（Sourthern印跡或點雜交等）檢測陰性的標(biāo)本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時機(jī)對比，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是特不有益的。假如擴(kuò)增結(jié)果中試劑對比為陽性結(jié)果，確實是某一種或數(shù)種試劑被污染了?，F(xiàn)在，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)立即處理。 （二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的

17、可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)覺試劑被污染了，假如預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源要緊有： 1.模板提取時真空抽干裝置； 2.凝膠電泳加樣器； 3.電泳裝置； 4.紫外分析儀； 5.切膠用刀或手術(shù)刀片； 6.HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-47.html t _blank離心機(jī)； 7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等； 現(xiàn)在可用擦拭實驗來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實驗；4）電泳檢測結(jié)果。 8.氣溶膠。假如通過上述追蹤實驗，仍不能查找到

18、確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，現(xiàn)在就應(yīng)該更換實驗場所，若條件不同意，則重新設(shè)計新的引物（與原引物無相關(guān)性）。 三污染處理 （一）環(huán)境污染 1.稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤； 2.紫外照耀（UV）法：紫外波長（nm）一般選擇254/300nm，照耀30min即可。需要注意的是，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時，要考慮PCR產(chǎn)物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV照耀僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。UV照耀時，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體

19、，且UV照耀還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV波長，嘧啶二聚體的類型及與二聚體位點相鄰HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-674.html t _blank核苷酸的序列。在受照耀的長DNA鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和 DNA斷裂等）均可終止TaqDNA聚合酶的延伸。這些位點的數(shù)量與二聚體位點相當(dāng)。假如這些位點（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布，一個 500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點，那么，105個如此的分子中每個分子中會至

20、少有一處損傷。相反，假如100bp的片段，每條鏈上僅有 6處損傷，105個拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。這確實是UV照耀有一定的片段長度限制的緣故。（二）反應(yīng)液污染 可采納下列方法之一處理： 1.DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室溫反應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點是不需要明白污染DNA的序列； 2.內(nèi)切酶法：選擇識不4個堿基的內(nèi)切酶（如MspI和TaqI等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識不特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR； 3.紫外照耀法：未加模板和Taq聚合酶的P

21、CR混合液進(jìn)行紫外照耀，注意事項與方法同上述UV照耀法； 4.g射線輻射法：1.5kGy的輻射可完全破壞0.1ng基因組DNA，2.0kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0kGy仍不阻礙PCR，但高于此限度會使PCR擴(kuò)增效率下降。引物可受照耀而不阻礙PCR，g射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基來破壞DNA的。（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法 由于UV照耀的去污染作用對500bp以下的片段效果不行，而臨床用于檢測的PCR擴(kuò)增片段通常為 300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和確信。 1.原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT。這種dU化的PCR產(chǎn)物與 UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶

22、堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對不含dU的模板無任何阻礙。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶，而對RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。 2.dUTP法：用 dUTP代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此可不能阻礙含dU的新的PCR產(chǎn)物。 3.dU引物法：合成引物時以dU代dT，如此PCR產(chǎn)物中僅5端帶 dU。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點而不能擴(kuò)增。對長片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用

23、dUTP法效率較用dTTP低，而用dU法就可克服這一缺點。 dU引物最好將dU設(shè)計在3端或近端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。 4.優(yōu)點：能夠去除任何來源的污染；UNG處理能夠和PCR擴(kuò)增在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在，可完全消除污染源。 5.需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有阻礙，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會被受體菌UNG消化掉。 （四）固相捕獲法 用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶

24、有生物素探針的雜交核酸，通過漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域。第2）步的漂洗后可用PCR檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。 （五）RS-PCR法（RNA-specificPCR） 也稱為鏈特異性PCR，要緊指用于 RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低假陽性而不阻礙PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3端（A區(qū)）有20個HYPERLINK N:整理后.ebioeypproduct-list-674.html t _blank核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5端20個核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)

25、超速離心使cDNA與多余引物分開，再用和第二引物（C）以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才可不能被擴(kuò)增。 （六）抗污染引物法 該對引物擴(kuò)增時通過病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個區(qū)域與克隆位點被。假如重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就能夠證明標(biāo)本是陽性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。 四其它PCR檢測方法： （一）兩步法：是指在用套式

26、 PCR方法擴(kuò)增某些含量低微的標(biāo)本時，兩對引物在同一個管中以簡化步驟，減少污染。通常第一步進(jìn)行20-25個循環(huán)，擴(kuò)增外引物片段；第二步再進(jìn)行10個循環(huán)，擴(kuò)增內(nèi)引物片段。兩步法對內(nèi)外引物的Tm值有專門要求，即內(nèi)外引物的退火溫度高（如68），在此溫度下內(nèi)引物不與模板退火，然后降低退火溫度（至 55）再擴(kuò)增內(nèi)引物片段，如此，在操作過程中，僅打開PCR反應(yīng)管一次，大大減少了污染的可能性。（二）熒光法：亦稱熒光PCR技術(shù)（fluoresencePCR,F-PCR），是1995年由美國PE公司首先研制成功的，它融匯了 PCR的靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，電腦同步跟蹤，數(shù)據(jù)自動化處理，直接探測PCR過程中的變化以獲得定量的結(jié)果，不需要做 PCR后處理或檢測，完全閉管操作。探針標(biāo)