Q-PCR常見問題及解決方法

1、QPCRQPCR一般來講，進行e一般來講，進行eRx都是的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于eR靈敏度高，所以每個樣本至少3CtS100-400mM；模RNA10ng-500cNA1ul或者1ul 1ul 10 倍稀釋液，要根據(jù)目的基因 的表達豐度進行調(diào)整。當然這些都是經(jīng)驗值，在操作進程中，還需要根據(jù)所用驗值，在操作進程中，還需要根據(jù)所用x，模板和引物的不同進行優(yōu)化，達到一個最佳反映體系。在反映體 系配置進程中，有下面幾點需要注意：化，達到一個最佳反映體系。在反映體 系配置進程中，有下面幾點需要注意：.x不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。2.2.Mix進行，減少加樣誤差。最

2、好能在冰上操作。3.3.每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！4.4.一切成分加完后，離心去除氣泡。5.5.3個平行孔。參比或者校正染（參比或者校正染（ee常用的是ROXT（現(xiàn)ABI 的注冊商標了PCR 產(chǎn)物的熒PCR 震蕩，校正ROXTMROXTM配制在x或者 e里。如果反映曲線良好或已經(jīng)ROXTM 染料校正。通常來講通常來講eR的反映程序不需要像常規(guī)的R那樣要變性、退火、延伸3性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBRGreenPCR擴增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR 產(chǎn)物的特 異性擴增。而溶解程序，

3、號的收集。3.3.儀器設(shè)置一切儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候囊括反映板設(shè)置（一切儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候囊括反映板設(shè)置（ep）和程序設(shè)置m）。我們以 Ie為例，詳細看一下反應(yīng)設(shè)置：應(yīng)設(shè)置：A.A.“定量”實驗。.實驗方法的選擇：我們選用的比較t的Rn方法， cNA 為模板進行。C.C.目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。.樣本的設(shè)置：囊括哪個是實驗組，哪個是關(guān)于照組。以及負關(guān)于照的設(shè)置和生物反復(fù)的設(shè)置。生物反復(fù)的設(shè)置。E.E.關(guān)于照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準備.反映程序的設(shè)置.反映程序的設(shè)置R反映程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的x。比如BioTeke的952分鐘

4、就可以激活NA聚合（ABI的需要10分鐘951540個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。認設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。G.G.反映體系的設(shè)置：A-G A-G ABIABIROXROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在x里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不 同公司的x進行這一個步驟的選擇。e的x里沒有參比染料，所以選擇“none”。PCR RUN！五、五、Real-timeR數(shù)據(jù)分析.Real-timeR常見參數(shù)基線（基線（e）3-15 個循環(huán)的熒光信號3-15 個循環(huán)的熒光信號同一次反映中針關(guān)于不同的基因需單獨設(shè)置基線閾值（threshol）

5、3-153-1510倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號鮮明增強。要用同一個閾值。Ct 值:與起始濃度的關(guān)于數(shù)成線性關(guān)系。Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準確。RR（）是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。的熒光發(fā)射強度的比值。 Rn： RnRn扣除基線后得到的標準化結(jié)果（ Rn=Rn-基線）。2.Ct 2.Ct 值的關(guān)鍵因素模板濃度模板濃度是決定CtCt在15-35之間。之間。反映液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響反映液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響pH 值和鹽濃度。PCR PCR 反映的效率PCRCtPCRCt

6、PCR擴增效率低的條件下進行連續(xù)梯PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標準曲線。PCR 效率取決于實驗、反映混合液性能和樣本質(zhì)量。一般說來，反映效90-110%之間都是可以接受的。3.3.PCR反映的效果PCRPCRPCRPCR3次平行重5 個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。常見問題1.Ct值出現(xiàn)檢測熒光信號的步驟有檢測熒光信號的步驟有誤:一般G法采用2延伸時采集n法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。引物或探針降解引物或探針降解:可經(jīng)過PAGE電泳檢測其完整性。模板量不足模板量不足:關(guān)于未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高

7、濃度做起。模板降解模板降解:避免樣本制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。2. Ct 2. Ct 值出現(xiàn)過晚（Ct38）擴增效率低擴增效率低:反映條件不夠優(yōu)化設(shè)計更好的引物或探針改用三步法進行反映；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。反映；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。PCR PCR 各種反映成分的降解或加樣量的不足。PCRPCR產(chǎn)物太長:一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。3.3.標準曲線線性關(guān)系不佳加樣存在誤差加樣存在誤差:使得標準品不呈梯度。標準品出現(xiàn)降解標準品出現(xiàn)降解:應(yīng)避免標準品反復(fù)凍融，或重新制備并且稀釋標準品。引物或探針不佳:重新設(shè)計更好的引物和探針。模板中存在克制物，或模板濃

8、渡過高4.負關(guān)于照有信號引物或探針不佳:重新設(shè)計更好的引物和探針。模板中存在克制物，或模板濃渡過高4.負關(guān)于照有信號引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并且注意上下游引物的濃度配比。mix 試劑盒。模板有基因組的污染：模板有基因組的污染：RNANA的引入，或經(jīng)過引物設(shè)計避免非特異擴增。引物設(shè)計避免非特異擴增。5.溶解曲線不止一個主峰引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并且注意上下游引物的濃度配比。5.溶解曲線不止一個主峰引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。引物濃度不佳：適當降低引

9、物的濃度，并且注意上下游引物的濃度配比。鎂離子濃渡過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix試劑盒。模板有基因組的污染：模板有基因組的污染：RNANA的引入，或經(jīng)過引物設(shè)計避免非特異擴增。引物設(shè)計避免非特異擴增。6.擴增效率低反映試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反映條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。6.擴增效率低反映試劑中部分成分特別是熒光染料降解。反映條件不夠優(yōu)化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。PCR 度稀釋，再加入反映體系中，減少克制物的影響。度稀釋，再加入反映體系中，減少克制物的影響。7.同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？判斷標準：擴增效率，靈敏

10、度，特異性7.同一試劑在不同儀器上產(chǎn)生不同的曲線，如何判斷？判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性90%-110%8.8.擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？參比染料設(shè)定不正確x參比染料設(shè)定不正確x不加參比染料時，選模板的濃度太高或者降解熒光染料的降解PCR 問題匯總1.PCR1.PCR儀的開關(guān)機順序是怎樣的？的頻率。PCR 儀主機，等主機PCR 的收集軟件，進行實驗。關(guān)機順序：確認實驗已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR 儀主機的電源，最后關(guān)閉電腦。方？PCR方？PCRml2lABIPCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：2.PCR實驗使用？有何需要注意的地3.3.為什么要定期關(guān)于電

11、腦進行磁盤碎片整理？怎樣整理？PCR 碎片整理的方法如下：碎片整理的方法如下：Winows桌面上，選擇開始(start)，我的電腦(Mycomputer)。在(在(我的電腦)窗口中，用鼠標右鍵單擊硬盤驅(qū)動器，并且選擇(屬性)property。在在(屬性)關(guān)于話框中選擇工具(Tools)選項卡，單擊開始整理(efragmentnow)now)。單擊碎片整理單擊碎片整理(efragment)。當顯示當顯示“碎片整理完畢”關(guān)于話框時，單擊（確定）。在在“本地磁盤屬性”關(guān)于話框中，單擊（確定）。為計算機機中剩余的驅(qū)動器反復(fù)如上步驟。為計算機機中剩余的驅(qū)動器反復(fù)如上步驟。.何時執(zhí)行sek更新？則請不要更

12、新控制定量則請不要更新控制定量PCR儀的計算機的操作系統(tǒng)。新版本的MicrosoftWinows操作系統(tǒng)有可能與SS軟件存在沖突，并且導(dǎo)致儀器不能正常運行。如果您希望安裝如果您希望安裝ek（更新包）以更新操作系統(tǒng)，應(yīng)察看隨S軟件提供的版本說明，避免兼容性問題。件提供的版本說明，避免兼容性問題。5.應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？5.應(yīng)該備份哪些數(shù)據(jù)？PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗C:/Appliebiosystems/SS ocument。下圖是校正文件的樣本。圖是校正文件的樣本。6.怎么樣的實驗室環(huán)境才能保證儀器設(shè)備正常運行？薦做到以下幾個方面：6.怎么樣的實驗室環(huán)境才能保證儀器

13、設(shè)備正常運行？薦做到以下幾個方面：UPS 或穩(wěn)壓器。通風：儀器的通風應(yīng)該沒有阻擋。10-30C 之間。濕度：20-80%；關(guān)于于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機?？臻g：易于操作，安全。7.濕度：20-80%；關(guān)于于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機?？臻g：易于操作，安全。7.pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。ROI 的校正，當某個孔的信號鮮明高出其他孔時，則表明該孔被污染。當某個孔的信號鮮明高出其他孔時，則表明該孔被污染。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并且滴入每個污染的反映孔中。清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇

14、并且滴入每個污染的反映孔中。吹打數(shù)次。吹打數(shù)次。將廢液吸入廢液杯中。反復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認反映孔中的殘留液體蒸發(fā)完。8.將廢液吸入廢液杯中。反復(fù)以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認反映孔中的殘留液體蒸發(fā)完。8.什么是背景校正？多長時間執(zhí)行一次背景校正？PCR PCR PCR10分鐘內(nèi)連續(xù)讀取背景校正板的熒光強度，CS實驗數(shù) 據(jù)中扣除背景信號。因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反映板因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反映板/反應(yīng)管的生產(chǎn)廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。應(yīng)管的生產(chǎn)廠

15、商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。9.什么是純熒光校正？多長時間校正一次？9.什么是純熒光校正？多長時間校正一次？而確定樣 品中的熒光染料種類和信號強度。ROI 校正。10.9610.96孔板怎樣封膜？96 96 96 壓使之密封。壓使之密封。11.11.8 連管做實驗時，在樣本加熱塊上應(yīng)該怎樣安排放置？8 連管做實驗，并且且樣本數(shù)量不多的時候，建議在樣本加熱塊(TRAY)上關(guān)于稱地安放樣本，最好是縱向放置，并且且優(yōu)先放在第6 列或第 7 列，然后 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜，各然后 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處

16、是熱蓋壓下來的時候不至于發(fā)生傾斜，各個反映管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性個反映管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數(shù)據(jù)精密性.12.絕關(guān)于定量與相關(guān)于定量有什么區(qū)別？絕關(guān)于定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝12.絕關(guān)于定量與相關(guān)于定量有什么區(qū)別？絕關(guān)于定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說的拷貝不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。100%，將經(jīng)處理的樣關(guān)于于未處理樣本的百分比。量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。量可以做標準曲線，也可以不做標準曲線。CT NA RNA 的稀釋比例而不pg 數(shù)的樣本做一系列梯度稀釋。梯度稀釋

17、。CTCTCTNA濃度的關(guān)于數(shù)成反比的數(shù)學關(guān)系，來計算不同樣本之間的相關(guān)于百分比，其計算公式是。計算不同樣本之間的相關(guān)于百分比，其計算公式是。NA 含量比較困難。有許多商業(yè)性的標準品試劑盒供選購，可以解決這種困難。困難。有許多商業(yè)性的標準品試劑盒供選購，可以解決這種困難。驗數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。13.驗數(shù)據(jù)的解釋有一定難度。13.PCR基因表達的實驗數(shù)據(jù)應(yīng)該如何處理？總的來說，有三個層次的校正是必需要做的。ROX，這樣由于反映總PCR ROX 校正能夠極大地改進定量的精確度，提高反復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。夠極大地改進定量的精確度，提高反復(fù)管之間的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性。含量是 必要的。方法是在定量目的基因（

18、含量是 必要的。方法是在定量目的基因（IL-2）的同時定量一個內(nèi)關(guān)于照基因（因（18S RNA 基因），IL-2/18S。內(nèi)關(guān)于照校正使不同樣本的實驗數(shù)據(jù)可以相互比較。據(jù)可以相互比較。第三，計算相關(guān)于于基準樣本)第三，計算相關(guān)于于基準樣本)的相關(guān)于基因含量。比如研究處理和未處理的、06小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。14.14.標準曲線法相關(guān)于定量的數(shù)據(jù)應(yīng)該怎么處理？0、0、24、48IL-2基因在某種組18SRNA基因。IL-218SRNARNApg數(shù)，數(shù)據(jù)的處理方法見下表：15.15.CT值比較法？數(shù)據(jù)怎么處理？CTCTNA濃度

19、的關(guān)于數(shù)成反比：如果(1)PCR如果(1)PCR反映效率相同；(2)PCR的反映效率接近100%，可以從上面的公式推出相關(guān)于含量(X01/X02)=2 -CT。假設(shè)實驗的0、24、48IL-2基因在某種組織中的表達量的18S RNAIL-2 18S RNACTRNApg數(shù)。16.16.每個反映管中可以加入多少種探針？幾個方面。幾個方面。首先是儀器的硬件構(gòu)成和軟件的解析能力。在軟件解析能力足夠的前提下，PCR儀如激光管-CC類型關(guān)于于探針的數(shù)量實際上是沒有限制 的。如果信號的采集要經(jīng)過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，制 的。如果信號的采集要經(jīng)過濾色片，那么探針的數(shù)量取決于濾色片的數(shù)目，AB 公司的儀器為 例，7900器為 例，79007700是激光-全波長檢測的，7000、73004色濾色片的，75005色濾色片的。45種熒光的水平。PCR ROX校正熒光PCR ROX校正熒光占去一種熒光n探針的淬滅基團)也要占用一種 熒光，關(guān)于于4 色檢測的儀器來說，只剩下2 種熒光可以標記探針，關(guān)于于5 色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用nB探針，由于它的淬滅基團是不發(fā)熒光的比之n探針就可以多1種熒光用于標記探針ROX校正（AB公司不推薦這樣 做