檢驗(yàn)主管技師-臨床免疫學(xué)和免疫2021全1

1、第一節(jié) 放射免疫技術(shù)一、基本類型及原理（一）放射免疫分析（RIA）以放射性核素標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體，測(cè)定樣品中抗原量的一種分析法。（二）免疫放射分析（IRMA）用放射性核素標(biāo)記的過量抗體與待測(cè)抗原直接結(jié)合，固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法。二、常用的放射性核素125I、131I、3H、14C 等，使用最廣泛的是 125I。三、放射性標(biāo)記物及鑒定（一）原理：以放射性碘原子置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。蛋白質(zhì)、肽類等含有上述基團(tuán)，可用 125直接標(biāo)記，不含上述基團(tuán)的甾體激素或藥物分子，須連接相應(yīng)基團(tuán)才能用于放射性碘標(biāo)記。（二

2、）標(biāo)記及類型直接標(biāo)記法：肽類、蛋白質(zhì)和酶的碘化標(biāo)記。常用的方法為：氯胺 T（ch-T）法；乳過氧化物酶標(biāo)記法。間接標(biāo)記法：也稱連接標(biāo)記法，是最常用的間接碘標(biāo)記方法。該法主用于甾體類化合物、環(huán)核苷酸、素等缺乏碘標(biāo)記基團(tuán)的小分子化合物的標(biāo)記。（三）放射標(biāo)記物的純化凝膠過濾法：分子篩機(jī)制。離子交換層析法：游離 125與標(biāo)記物分子極性差異進(jìn)行吸附解離。聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）：按分子所帶電荷和直徑不同在電場(chǎng)作用下分子遷移速率不同。高效液相色譜法。（四）放射標(biāo)記的鑒定1.放射化學(xué)純度：標(biāo)記物中結(jié)合于被標(biāo)記物上的放射性占總放射性的百分率，要求95%。該參數(shù)還是觀察在期內(nèi)標(biāo)記物脫碘程度的重要指標(biāo)。2

3、.免疫活性：的標(biāo)記物與抗體結(jié)合的能力。3.比放射活性：數(shù)目?；瘜W(xué)量標(biāo)記物中所含的放射性強(qiáng)度，即每分子被標(biāo)記物平均所結(jié)合放射性原子四、方法學(xué)評(píng)價(jià)除常規(guī)的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性等指標(biāo)外，還應(yīng)注意以下指標(biāo)：（一）可靠性：又稱健全性，是評(píng)價(jià)被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)品的免疫活性是否相同。借助標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品稀釋曲線的平行性分析來判斷。平行性好者可靠。（二）劑量-反應(yīng)曲線：通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)的反應(yīng)參數(shù)繪制成劑量-反應(yīng)曲線，待測(cè)物定量是通過計(jì)算其反應(yīng)參數(shù)在劑量-反應(yīng)曲線上對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值而確定。（三）高劑量鉤狀效應(yīng)：標(biāo)本中被測(cè)物濃度超過線性范圍上限時(shí)，所得結(jié)果反而降低或呈象?？梢酝ㄟ^選用髙親和力

4、抗體或?qū)Υ祟悩?biāo)本進(jìn)行稀釋后測(cè)定以改善或消除。的現(xiàn)第二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析（RIA）是以放射性核素作示蹤劑的標(biāo)記免疫分析方法，特別適用于激素、多肽等的超微量分析。一、基本原理經(jīng)典 RIA 是采用標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合有限量特異性抗體的反應(yīng)。二、實(shí)驗(yàn)方法及測(cè)定（一）抗原抗體反應(yīng)：將未標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）、標(biāo)記抗原和特異性抗體加入反應(yīng)試管中，在一定條件（溫度、時(shí)間及介質(zhì) pH）下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)。先加待測(cè)樣品（或標(biāo)準(zhǔn)品）和抗?fàn)幣c抗體結(jié)合。，使非標(biāo)記抗原與抗體達(dá)到結(jié)合平衡，然后再加入標(biāo)記抗原競(jìng)（二）分離結(jié)合與游離標(biāo)記物：RIA 反應(yīng)平衡后，標(biāo)記抗原與試劑抗體形成免疫復(fù)合物（B）

5、。由于其含量極少，不能自行沉淀，需加入適當(dāng)?shù)某恋韯⑵鋸氐壮恋?，然后?jīng)離心使其與游離的標(biāo)記抗原分離。某些小分子抗原，也可采用吸附法分離B 與 F。分離方法包括：第二抗體沉淀法：反應(yīng)完成后加入二抗形成復(fù)合沉淀。為增強(qiáng)效果可加入一定量的與一抗同種動(dòng)物的或 IgG，或是將二抗與某些顆粒固相物連接。2.聚乙二醇（PEG）沉淀法：能非特異地沉淀抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白質(zhì)，而不沉淀小分子抗原。當(dāng)溫度髙于 30時(shí)，沉淀物易復(fù)溶。3.PR 試劑法：先將二抗與 PEG 按一定比例混了二者的用量，且分離迅速，簡(jiǎn)便。懸液后進(jìn)行試驗(yàn)。此法保留了二者的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)省4.活性炭吸附法：活性炭可吸附小分子游離抗原或半抗原，而

6、大分子蛋白（如抗體和免疫復(fù)合物）則留在溶液中。（三）放射性測(cè)量及數(shù)據(jù)處理分離 B（免疫復(fù)合物）、F（游離標(biāo)記抗原）后，可分別對(duì)二者進(jìn)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（劑量-反應(yīng)曲線），樣品管以其測(cè)量或計(jì)算的反應(yīng)參數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出相應(yīng)的待檢抗原濃度。第三節(jié) 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是以過量 125I 標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行非競(jìng)爭(zhēng)性免疫結(jié)合反應(yīng)，用固相免疫吸附劑對(duì) B 或 F 進(jìn)行分離，其靈敏度和可測(cè)范圍均優(yōu)于 RIA，操作程序較 RIA 簡(jiǎn)單。一、基本原理1.點(diǎn) IRMA：利用過量標(biāo)記抗體與待測(cè)抗原進(jìn)行反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，反應(yīng)平衡后，再用固相抗原結(jié)合反應(yīng)液中剩余的未結(jié)合標(biāo)記抗體并將其

7、分離，測(cè)定上清液的放射量。2.雙位點(diǎn) IRMA：先用固相抗體與抗原反應(yīng)結(jié)合，然后再用過量的標(biāo)記抗體與已結(jié)合于固相的抗原的另一抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗棄反應(yīng)液中剩余的標(biāo)記抗體，測(cè)定固相上的放射性。兩種 IRMA 最后測(cè)得的放射性均與樣品中待測(cè)抗原的含量呈正相關(guān)。二、IRMA 與 RIA 的比較RIAIRMA標(biāo)記物標(biāo)記抗原（抗原不同，標(biāo)記物和標(biāo)記方法不同）標(biāo)記抗體（方法基本相同）反應(yīng)速率較慢抗體過量，反應(yīng)速率稍快反應(yīng)原理競(jìng)爭(zhēng)抑制性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原量成反比非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，反應(yīng)參數(shù)與待檢抗原濃度呈正相關(guān)第四節(jié) 放射免疫分析技術(shù)的應(yīng)用常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)

8、志物和藥物等微量物質(zhì)的測(cè)定。但具有放射污染和危害，常用放射性核素半衰期短，試劑盒有效期不長(zhǎng)，無法自動(dòng)化分析等諸多不足。下列有關(guān)放射免疫分析的敘述中，錯(cuò)誤的是A.以放射性核素作為標(biāo)記物 B.是一種定量檢測(cè)技術(shù)C.主要用于抗原檢測(cè)D.形成的免疫復(fù)合物中的放射強(qiáng)度與待測(cè)抗原含量成正比 E.定量分析時(shí)需同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)管正確D放射免疫分析形成的免疫復(fù)合物中的放射強(qiáng)度與待測(cè)抗原含量成反比。在放射免疫分析檢測(cè)中，B/（B+F）表示（注：B 為結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原，F(xiàn) 為游離態(tài)的標(biāo)記抗原）A.結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與總的標(biāo)記抗原之比 B.結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與游離的標(biāo)記抗原之比 C.總標(biāo)記抗原與抗原抗體復(fù)合物之比D.結(jié)合態(tài)的抗

9、原與總抗體之比E.結(jié)合態(tài)的抗原與總抗原之比正確A在放射免疫分析檢測(cè)中，B/（B+F）表示結(jié)合態(tài)的標(biāo)記抗原與總的標(biāo)記抗原之比。在 RIA 反應(yīng)系統(tǒng)中，參與反應(yīng)的有標(biāo)記抗原、已知抗體和待測(cè)抗原，對(duì)這三種成分的要求是A.只需固定標(biāo)記抗原量 B.待測(cè)抗原要先標(biāo)記C.標(biāo)記抗原和已知抗體的量都是固定量的 D.只需要固定已知抗體的量E.三者的量均需固定正確C在 RIA 反應(yīng)系統(tǒng)中，參與反應(yīng)的有標(biāo)記抗原、已知抗體和待測(cè)抗原，其中標(biāo)記抗原和已知抗體的量都是固定量的。臨通常不利于放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)的是微量蛋白質(zhì)激素特異性特異性較低雙抗體，反應(yīng)不易受交叉反應(yīng)物干擾，特異性較高靈敏度抗原與限量抗體的結(jié)合不充分，靈微量抗原可與抗體充分結(jié)合，靈敏度高敏度低標(biāo)準(zhǔn)曲線較窄工作范圍寬 12 個(gè)數(shù)量級(jí)抗體特點(diǎn)多克隆抗體，用量少親和力要求低，用量多用途測(cè)定大分子和小分子抗原測(cè)定至少有兩個(gè)抗原決定簇的抗原C.小分子藥物D.腫瘤標(biāo)記物 E.免疫球蛋白正確E免疫球蛋白比較大，不用放射免疫分析技術(shù)檢測(cè)。臨放射免疫分析最常用的放射性核素是A.125I B.131I C.3H D.14CE.51Gr正