深黃被孢霉Δ6脂肪酸脫氫酶基因的原核表達(dá)和轉(zhuǎn)基因植株再生研

1、王廣科,李明春,李晉川,刑來君1質(zhì)料與要領(lǐng)11植物質(zhì)料綏農(nóng)10和吉林47等兩個(gè)精良品種，由吉林省農(nóng)科院大豆研究所提供。12菌株與質(zhì)粒AgrbateriutuefaiensLBA4404，由中科院微生物所方榮祥老師奉送。pGA643Kanr，由內(nèi)蒙古大學(xué)哈斯阿古拉傳授惠贈(zèng)。pTIL6Apr全長(zhǎng)ID6DDNA，南開大學(xué)真菌實(shí)行室保存。13重要試劑14造就基的配制LB、YEB、S及SB造就基配方拜見文獻(xiàn)10。15抗生素與激素的配制配制要領(lǐng)拜見文獻(xiàn)10。16植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化17農(nóng)桿菌的造就從保存的農(nóng)桿菌平板上挑取含有表達(dá)載體的單菌落，接入含有50g/LKan、25g/LRif、25g/

2、LStr的YEB造就基中，28，145r/in振蕩造就。挑取無病斑且種皮齊備的大豆種子，凈水浸泡留宿后去種皮，置于1/2SB或S固體造就基造就，幾天后得到無菌苗。切取子葉節(jié)外植體并制造傷口并農(nóng)桿菌菌液熏染，熏染后置于幼芽固體造就基中誘導(dǎo)分化出芽。待抗性芽在伸長(zhǎng)造就基中長(zhǎng)到34后轉(zhuǎn)到生根造就基中，1520d后可得到大豆轉(zhuǎn)基因抗性小植株，當(dāng)根充實(shí)發(fā)育后，將幼苗移栽到花盆?？剐栽偕缭诨ㄅ枥飪蓚€(gè)月開始結(jié)籽，勞績(jī)后，對(duì)部門子1代的種子舉行脂肪酸構(gòu)成和含量的測(cè)定，別的種子種于溫室中，即為T1代轉(zhuǎn)基因植株。19轉(zhuǎn)基因植株的PR檢測(cè)110轉(zhuǎn)基因植株的Suthern檢測(cè)111轉(zhuǎn)基因大豆脂肪酸的氣相色譜G闡發(fā)取

3、一粒轉(zhuǎn)基因陽性大豆種子，提取脂肪酸后舉行氣相色譜G闡發(fā)，氣相色譜測(cè)定由南開大學(xué)中央實(shí)行室完成。2效果與闡發(fā)21植物表達(dá)載體的構(gòu)建22預(yù)處置懲罰對(duì)誘導(dǎo)從生芽的影響在子葉節(jié)外植體得到后，轉(zhuǎn)移到預(yù)造就基中培表1預(yù)處置懲罰對(duì)大豆叢生芽誘導(dǎo)的影響?zhàn)B2436h，然后舉行農(nóng)桿菌的熏染。同時(shí)以未經(jīng)預(yù)造就基造就和在預(yù)造就基造就140h的子葉節(jié)誘導(dǎo)從生芽舉行比力可知：未經(jīng)預(yù)造就基造就的子葉節(jié)要比顛末預(yù)造就2436h的子葉節(jié)推延35d擺布出現(xiàn)從生芽。將子葉節(jié)預(yù)造就140h，那么子葉節(jié)誘導(dǎo)叢生芽率會(huì)急劇落落見表1。緣故原由大概是短時(shí)間的預(yù)造就有助于暗語細(xì)胞進(jìn)入傷口修復(fù)反響，產(chǎn)生必然數(shù)目的愈傷，而長(zhǎng)時(shí)間在誘導(dǎo)愈傷造就基

4、上預(yù)造就，攔阻了細(xì)胞進(jìn)一步分化生長(zhǎng)，加速了細(xì)胞的老化及褐化歷程，因此使誘導(dǎo)叢生芽率不竭落落見圖2。23T1代轉(zhuǎn)基因株系的蒔植及被轉(zhuǎn)基因的遺傳生根的轉(zhuǎn)基因抗性苗蒔植到造就土中見圖3，顛末約20d后開始結(jié)莢見圖4，1個(gè)半月后從T0植株上勞績(jī)T1種子，但種粒一樣平常比正常的籽粒小，按株系蒔植在花盆中。種子的萌發(fā)率約為80%，全部萌發(fā)的種子都著花結(jié)莢。每個(gè)株系別離單株取葉片提取DNA舉行PR擴(kuò)增以檢測(cè)被轉(zhuǎn)基因的遺傳，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效果見表2。24轉(zhuǎn)基因植株的PR檢測(cè)使用TAB法提取大豆轉(zhuǎn)化抗性再生苗T0代表2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化效果現(xiàn)實(shí)轉(zhuǎn)化率=T0PR陽性數(shù)/外植體總數(shù)100%.Re

5、alfrequeny=T0/Ttalexplant*100%.和T1代葉片中的總DNA，以質(zhì)料和要領(lǐng)中的PR反響條件舉行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)。效果在吉林47和綏農(nóng)10共120棵抗性再生植株中，有75棵此中24棵吉林47和51棵綏農(nóng)10，擴(kuò)增出了約1.37kb的目的帶，而未轉(zhuǎn)化的比較那么無此目的帶，PR陽性率為63.07%.現(xiàn)實(shí)轉(zhuǎn)化率為1.00%(見圖5、6)。25斑點(diǎn)雜交闡發(fā)提取部門PR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因植株葉片的總DNA舉行斑點(diǎn)雜交見圖7。26Suthern雜交闡發(fā)27轉(zhuǎn)基因大豆的脂肪酸的氣相色譜G闡發(fā)把顛末斑點(diǎn)雜交和Suthern雜交檢測(cè)斷定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株的種子單粒研磨，舉行脂肪酸提取，甲酯化

6、后，舉行脂肪酸的G闡發(fā)。271吉林47轉(zhuǎn)基因大豆的脂肪酸的闡發(fā)由尺度品GLA見圖9A，比較吉林47未轉(zhuǎn)化植株的種子見圖9B和轉(zhuǎn)化植株的種子見圖9比力可知：圖A所示轉(zhuǎn)基因大豆中出現(xiàn)了一個(gè)特別峰，出峰時(shí)間為12.578in，與尺度品GLA的出峰時(shí)間12.632in相對(duì)應(yīng)，而比較未轉(zhuǎn)化植株的種子中沒有這一特別峰，說明深黃被孢霉的D6D基因在轉(zhuǎn)基因大豆吉林47中得到表達(dá)，其表達(dá)量占總脂肪酸的6.047%.GLA的出現(xiàn)與亞油酸含量的低落呈顯著的同等干系，比較種子中亞油酸含量為54.244%，而轉(zhuǎn)基因大豆的種子中，亞油酸含量別離為51.010%和48.987%.272綏農(nóng)10轉(zhuǎn)基因大豆的脂肪酸的闡發(fā)由尺度

7、品GLA見圖9A，比較綏農(nóng)10未轉(zhuǎn)化植株的種子見圖9D和轉(zhuǎn)化植株的種子見圖9E和圖9F比力可知：圖9E所示T1代轉(zhuǎn)基因大豆中出現(xiàn)了一個(gè)特別峰，出峰時(shí)間為12.593in，與尺度品GLA的出峰時(shí)間12.632in相對(duì)應(yīng)，比較未轉(zhuǎn)化植株的種子中沒有這一特別峰，說明深黃被孢霉的D6D基因在T1代大豆中得到表達(dá)，其表達(dá)量占總脂肪酸的5.678%.圖9F所示T2代轉(zhuǎn)基因大豆中出現(xiàn)了一個(gè)特別峰，出峰時(shí)間為12.598in，其含量為6.226%，說明深黃被孢霉的D6D基因在轉(zhuǎn)基因大豆綏農(nóng)10中可以或許不變遺傳。GLA的出現(xiàn)與亞油酸含量的低落呈顯著的同等干系，比較種子中亞油酸含量為57.376%，而轉(zhuǎn)基因大豆的種子中，亞油酸含量別離為54.088%和53.313%.3討論別的，在使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因研究中，較小的表達(dá)載體更利于轉(zhuǎn)化服從的進(jìn)步，在以