常規(guī)PCR實驗演示文稿

1、常規(guī)PCR實驗演示文稿第一頁，共三十三頁。掌握： 1、PCR的基本操作方法。 2、瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的基本原理和方法。理解： 1、PCR儀的使用方法。了解： 1、PCR體外擴增的原理及其引物設計原則。 2、擴增過程中各因素對擴增結果的影響。教學目的：第二頁，共三十三頁。1、PCR反應體系的建立。2、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。教學重點：教學難點： 1、PCR反應程序的設計方法。第三頁，共三十三頁。一、基本原理聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）：體外DNA酶促擴增技術，能特異高效地在體外擴增目的DNA片段。第四頁，共三十三頁。PCR反應的基本步驟

2、變性94C雙鏈DNA模板被加熱變性成兩條單鏈退火4560 C（Tm-5C）寡聚核苷酸引物按堿基互補配對原則與單鏈模板DNA特異結合延伸72CDNA聚合酶作用下，以引物為起始，合成與模板DNA互補的新鏈第五頁，共三十三頁。Cycle 255 555Primer 15Primer 2Cycle 1 5 5Template DNAPCR技術的工作原理55 555 5 55第六頁，共三十三頁。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。第七頁，共三十三頁。瓊脂糖凝膠電泳原理把DNA樣品加入到瓊脂糖凝膠的樣品孔中，并置于靜電場上

3、。由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側帶有含負電荷的磷酸根殘基，因此在電場中向正極移動。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，因而可依據DNA分子的大小來使其分離。在電泳前向凝膠或樣品中預加示蹤染料，電泳過程中染料同DNA結合，電泳后在紫外光照射下，可觀察到熒光，從而對分離的DNA進行檢測。第八頁，共三十三頁。二、操作步驟第九頁，共三十三頁。模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反應緩沖液（含Mg2+） PCR反應的基本組分第十頁，共三十三頁。10PCR緩沖液（Mg2+Plus） 5ldNTP混合物（2.5 mM） 4l上游引物（10M） 2l下游引物（10M） 2

4、lDNA模板 4lTaq DNA聚合酶（2.5 U/l） 1l去離子水 32l實驗步驟一：PCR反應體系的建立（重點）50 l2345671加樣順序第十一頁，共三十三頁。PCR反應程序的設計（難點） 預變性： 94 5 min 變性： 94 30 sec 退火： 55 30 sec 延伸： 72 40 sec(60 sec) 最終延伸： 72 5 min 保存： 4 for ever25cycles實驗步驟二：PCR反應程序的設計第十二頁，共三十三頁。PCR程序設計的主要因素循環(huán)溫度和時間Tm的概念： 在雙鏈DNA解鏈過程中，紫外吸光度的變化A260達到最大變化值的一般時所對應的溫度。Tm計算

5、方法堿基數小于20： Tm=4(GC%)+2(AT%)堿基數大于20： Tm=81.5+0.41(GC%) (675/引物長度)第十三頁，共三十三頁。主要實驗儀器PCR儀第十四頁，共三十三頁。主要實驗儀器PCR儀第十五頁，共三十三頁。實驗步驟三：結果檢測瓊脂糖電泳檢測PCR產物1. 試劑：50TAE電泳緩沖液：Tris 242 g，乙酸57.1 ml， 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 ml，定容至1 L，高壓滅菌后備用。1TAE電泳緩沖液：20 ml 50TAE電泳緩沖液加入雙蒸水，定容至1 L。2. 1瓊脂糖凝膠的配制： 100 ml TAE電泳緩沖液中加入1 g瓊脂糖，

6、搖勻后放入微波爐中，小火加熱幾分鐘至溶液透明位置，取出后冷卻至56左右時，加入微量（3.5 L）的EB（溴化乙錠），混勻后倒入槽中，冷卻后待用。第十六頁，共三十三頁。不同類型瓊脂糖分離DNA片段大小的范圍 瓊脂糖/標準高強度低熔點0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb第十七頁，共三十三頁。3. 上樣反應結束后取5L反應產物，加入1L上樣緩沖液（6loading buffer），用1%

7、瓊脂糖凝膠電泳檢測。 指示劑：溴酚藍Marker：DL2000。注意： 加樣孔位于負極，DNA由負極向正極泳動4060第十八頁，共三十三頁。4. 電泳 電泳100 V，10 min左右。5. 觀察 凝膠成像系統或紫外燈下觀察結果 （手套拿取凝膠）第十九頁，共三十三頁。三、注意事項 1、注意移液槍的正確使用方法。 2、按順序逐一加入PCR反應體系各組分，切勿遺漏。 3、取用各組分時，應避免污染和貼槍頭壁損失。 4、按操作步驟正確設置使用PCR儀。 5、帶手套操作實驗。第二十頁，共三十三頁。四、影響PCR反應的因素1、模板 任何來源的各種構型的含量極低的DNA樣品都可作PCR的模板。 輕微的污染都

8、會影響PCR的最終結果。2、脫氧核苷三磷酸（dNTPs） 4種dNTP在反應中濃度應相等，過高會抑制Taq酶活性，增加錯配的幾率。 第二十一頁，共三十三頁。3、引物(引物的好壞是整個PCR反應的關鍵) 引物濃度一般為0.10.5mmol/L，濃度太高，會增加非特異性擴增，形成引物二聚體；濃度太低，影響擴增效率和產率。*引物設計的原則長度15 30bpGC含量45 55%兩條引物退火溫度一致或接近，Tm差值小于5無連續(xù)核苷酸引物內部及引物間無互補，以免形成發(fā)夾結構和引物二聚體第二十二頁，共三十三頁。特異性的引物：特異性的產物第二十三頁，共三十三頁。4、Mg2+濃度Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮作用的

9、必須成分；最適濃度一般為0.5-2.5mmol/L,濃度過低則無法啟動反應，過高則影響產物特異性。 第二十四頁，共三十三頁。5、Taq DNA聚合酶 具有53DNA聚合活性外，還具有53DNA外切活性。因此，在某些時候可選擇具有校讀活性的聚合酶例如Pfu；可以根據需要選擇擴增長片段的Taq酶，高速擴增的Taq酶等 反應終濃度以22.5 U/100l為最佳 第二十五頁，共三十三頁。五、問題分析第二十六頁，共三十三頁。問題1：無擴增產物現象：正對照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B正對照第二十七頁，共三十三頁。純度：含有抑制物濃度：含量低質量：全長結構：二級結構 原因對策純化模板或者使用優(yōu)質試劑盒提

10、取模板DNA加大模板的用量用好的反轉錄酶用溫度高的反轉錄酶(1)無擴增產物之模板原因第二十八頁，共三十三頁。引物錯誤引物設計不好引物降解引物合成、純化不好 原因對策合成前檢查評價、重新設計引物換一管新引物免費重新合成(2)無擴增產物之引物原因第二十九頁，共三十三頁。退火溫度延伸時間循環(huán)次數 原因對策遞度PCR聚合酶的延伸速度適當增加循環(huán)數(3)無擴增產物之PCR條件原因第三十頁，共三十三頁。 現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶問題2：非特異性擴增 M 1 2第三十一頁，共三十三頁。引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數過多 原因對策重新設計引物或者使用巢式PCR適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低鎂離子濃