microRNA 的研究進展(整合版)

1、MicroRNA的研究進展microRNA生物學特征及功能microRNA的加工成熟microRNA的作用機制microRNA應用現(xiàn)狀目錄12345展望 1.microRNA的生物學特征及功能RNA的分類(1) 信使RNA(mRNA) (2) 轉運RNA(tRNA) (3) 核糖體RNA( rRNA) (4) 核酶(ribozyme) 和其它RNA 自我催化分子 (5) 基因組RNA(genome RNA) (6)指導RNA(guide RNA) (7)非編碼RNA (8) tmRNA (9) 小胞質RNA( small cytoplasmicRNA ,scRNA) (10) 小核RNA(sm

2、all nuclear RNA ,snRNA) (11) 核仁小RNA(small nucleolar RNA ,snoRNA) (12) 反義 RNA(antisense RNA)(13)端粒酶RNA (14) 小RNA 小RNA分子本身又包含了若干類RNA，根據(jù)小RNA 的生成、結構和功能大約可分為以下三類：miRNA （microRNA)siRNA (small interfering RNA)其他小RNAmicoRNA(miRNA)是廣泛存在于真核生物中的一組短小的、不編碼蛋白質的RNA家族，它們是由19-23個核苷酸組成的單鏈RNA（3端可有12個堿基長度的變化）microRNA的生

3、物學特征microRNA 廣泛地存在于多種真核生物中，從低等生物到人類都有其存在的痕跡。其生物學特性主要表現(xiàn)為：高度保守性，時序表達特異性和組織表達特異性,以及miRNA獨有的特征。高度保守性microRNA的序列結構在各個物種間具有高度的進化保守性，最具有microRNA 保守性的是let-7，它廣泛存在于兩側對稱的生物體中，其序列保守性令人吃驚?？蒲腥藛T認為，microRNA的保守性具有重要的生物學意義，提示在不同生物發(fā)育過程中，microRNA具有相同的調控機制，同時也為生物早期進化同源性提供了某種依據(jù)。 時序表達特異性在不同組織、不同發(fā)育階段中，microRNA的表達水平有顯著差異。一

4、些microRNA呈時間發(fā)育特異性表達，Neilson JR 等研究表明在細胞發(fā)育的不同階段mRNA表達是動態(tài)調控的。Ason B等研究發(fā)現(xiàn)，不同物種間許多microRNA 表現(xiàn)高度保守性，mRNA 表達變化越大，生理差別越大。物種間的差別最主要是由于microRNA 表達的異時性變化和較小程度的空間表達差異。由此，可以推測microRNA 表達的變化可能在動物發(fā)育過程中形成生理差別是其作用。 組織表達特異性一些microRNA 表達具有細胞和組織特異性，如miR-1720位于Hela細胞同一基因簇內(nèi)，并在斑馬魚細胞中表達，但在鼠腎和蛙卵巢細胞中未檢測到。這種特異性對microRNA 的調控功

5、能有重要意義。 miRNA獨有的特征：其5端第一個堿基對U有強烈的傾向性，而對G卻有抗性，但第二到第四個堿基缺乏U，一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏CmiRNA執(zhí)行一定的生物學功能：對與其互補的mRNA表達水平具有調節(jié)作用； 通過兩種機制調節(jié)靶基因的表達:(1) 結合到靶mRNA 3端非翻譯區(qū)(3U TRs) ,抑制其翻譯; (2)像siRNA 作用一樣結合到靶上并降解靶mRNA。一些偏大的miRNA (27nt)可能參與了基因組的重組；參與生物的發(fā)育與多種生理、病理過程；2.microRNA的加工成熟miRNA的生成需要兩個步驟：1)由長的內(nèi)源性轉錄本（pri-miRNA)經(jīng)

6、Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前體(pre-miRNA)，該過程發(fā)生在細胞核2)將pre-miRNA經(jīng)Dicer酶作用加工為成熟miRNA，該過程發(fā)生在細胞質中microRNA的加工成熟首先由基因組轉錄形成長鏈RNA分子pri-miRNAPri-miRNA經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt長度的pre-miRNAPre-miRNA在Exportin5介導作用下轉運出胞核至胞質中進行下一步加工Pre-miRNA在胞質中經(jīng)雙鏈RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成單鏈成熟miRNA分子3.microRNA的作用機制miRNA對靶基因的作用機制一直是眾多研究

7、人員的關注熱點。最早發(fā)現(xiàn)的兩個miRNAlin4和let-7被認為是通過不完全互補結合到靶基因mRNA 3UTR，以一種未知的方式抑制蛋白翻譯，進而抑制蛋白合成，阻斷mRNA的翻譯過程。后來的研究也發(fā)現(xiàn)，多個果蠅miRNA和它們的靶基因mRNA的3UTR存在部分同源。但由于有miRNA與其目標靶之間的互補是不完全的。用生物信息學的方法鑒定miRNA的目標靶位點并非易事。在植物中，由于miRNA與潛在的靶基因是完全互補的，使得植物的miRNA靶預測相對較容易。但這些預測基因是否就是miRNA的靶基因，還需要作進一步驗證。microRNA研究表明，microRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其

8、與靶基因的作用模式不同，主要可分為以下三種類型。1）作用時與靶基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA，常見于植物；2）作用時與靶基因不完全互補結合，進而阻止翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，這是目前發(fā)現(xiàn)最多的作用模式，常見于動物。3）具有以上兩種作用模式，當與靶基因完全互補結合時，直接靶向切割mRNA，當與靶基因不完全互補結合時，阻止靶基因的翻譯。microRNAmiRNA對靶基因的調控，正如前所述，pre-miRNA由exportin-5輸出至胞漿中，然后釋放pre-miRNA。pre-miRNA與Dicer互補結合，產(chǎn)生長度為22nt的不完全配對的雙鏈RNA（

9、dsRNA）。雙鏈中的一條為成熟的miRNA，另一條則為它的互補鏈。最后，雙鏈中成熟的miRNA與RNA誘導的RISC結合，隨后與靶mRNA互補。而互補鏈沒有結合RISC，因此在體內(nèi)是趨于降解的。對miRNA來說，發(fā)揮對靶基因的調控作用，Dicer和RISC是必不可少的。因為Dicer是產(chǎn)生miRNA不可或缺的，而RISC則是miRNA實現(xiàn)功能的載體。microRNAmiRNA介導的RISC簡稱miRISC（miRNA-containing RNA induced silencing complex），也被稱作miRNA核糖核蛋白復合體（miRNP）。miRISC復合體除了包括成熟miRNA外

10、，還包含Dicer蛋白和多種其他相關蛋白。其與RISC結合的原理與siRNA類似。以dsRNA為例，當雙鏈中兩根支鏈的穩(wěn)定性相似或相同時，它們結合進入RISC的概率也相似或相同，因此稱為等勢結合。當雙鏈中支鏈的穩(wěn)定性相對較弱時，解旋酶會從穩(wěn)定性弱的一支解開dsRNA，從而會偏向性地產(chǎn)生一條結合到RISC復合體上，這類結合稱為優(yōu)勢結合，未進入RISC的互補鏈RNA會很快降解。3.1 RNA誘導沉默復合體（RISC）的形成RISC是miRNA參與靶基因調控過程中不可或缺的載體。在miRISC復合體中，Dicer對pre-miRNA的處理與雙鏈螺旋的解旋是偶聯(lián)進行的。通常，只有一條鏈進入miRNA，

11、具體選擇雙鏈中哪一條鏈取決于堿基熱動力學穩(wěn)定性因素等因素。不進入RISC的miRNA鏈被稱之為伴隨連（passenger），并被冠以星號（*），具有更低的穩(wěn)定性，通常情況下被降解掉。但在某些情況下，兩條鏈均具有活性，成為針對不同靶基因mRNA的功能miRNA。RISC是具有多輪催化效應的酶。在這一過程中，其核心組分Ago2發(fā)揮重要作用。因此，在組成miRISC的蛋白質中，Ago蛋白家族成員在RISC功能中處于中心地位。 3.1 RNA誘導沉默復合體（RISC）的形成Ago家族蛋白為一類分子質量約為100kD的蛋白質，屬于進化保守的家族，包含有PAZ和Piwi兩個保守的RNA結合結構域，是目前唯

12、一一種在所有RNAi和miRNA通路中均可發(fā)現(xiàn)的蛋白。Ago蛋白與miRNA結合使其朝向正確，以便與靶基因mRNA作用。Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻譯抑制功能；一些Ago蛋白直接切割靶轉錄本。 Ago蛋白miRNA靶向互補mRNAs導致目的mRNA切割降解的過程被稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）。有效的PTGS需要RISC對mRNA轉錄本的切割。miRNA可以指導RISC在轉錄后水平下調基因的表達-mRNA的降解或翻譯抑制。采取何種沉默方式是由mRNA的特性所決定的。如果mRNA能夠與miRNA完全互補，該mRNA就會

13、被RISC特異地降解；如果mRNA不能與miRNA完全互補，僅在某個位點與miRNA互補，那么RISC就不會特異地降解mRNA，只是阻止mRNA作為翻譯的模板，使之不能合成蛋白質。3.2 miRNA誘導的基因沉默模式及其相關機制的形成在動物中，多數(shù)情況下復合物中的單鏈miRNA與靶mRNA的3UTR不完全互補配對，從而阻礙對該mRNA的翻譯，并以此來調控基因表達，但不影響mRNA的穩(wěn)定性。如線蟲中的miRNA lin-4就是以這種方式調控它的兩個靶基因lin-14和lin-28的翻譯。另一種主要的作用方式則與siRNA誘導的轉錄后基因沉默的PTGS相類似，當miRNA與mRNA完全互補配對時，

14、Ago蛋白可通過對mRNA的切割直接導致其降解，完成基因沉默調控。3.2 miRNA誘導的基因沉默模式及其相關機制的形成miRNA對翻譯起始抑制的相關機制主要有如下一些觀點：首先，mRNA可通過抑制核糖體的組裝來阻斷翻譯起始，進而起到對翻譯過程的抑制作用。miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子結構成為支持這一理論的重要依據(jù)，由此推斷miRISC可能通過對翻譯起始復合物形成抑制而發(fā)揮作用。還有一些觀點認為，通過影響靶mRNA脫腺嘌呤反應，導致其poly A尾縮短，從而使mRNA與poly A結合蛋白（poly A binding protein ,PABP）受阻進而影響蛋白質翻譯的起始

15、。3.2.1 miRNA的翻譯起始抑制與翻譯起始后抑制研究還表明，一些被miRNA作用后的mRNA可以與多核糖體偶聯(lián)，這些核糖體在翻譯中處于非?；钴S度狀態(tài)。此外，miRNA的抑制作用還可能發(fā)生在起始之后，這主要是由于其在翻譯過程的抑制作用是通過內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site, IRES），而不是依賴mRNA m7G帽子來發(fā)揮作用。其他作用方式，比如對新生多肽鏈的翻譯同步降解等目前還沒有定論，有待進一步證實。3.2.1 miRNA的翻譯起始抑制與翻譯起始后抑制miRNA可誘導與其不完全配對的靶mRNA衰減（降解）。通過Ago蛋白定位于如P小體（pro

16、cessing bodies, P-bodies）等的RNA顆粒（RNA granules）中，這些顆粒中包含有mRNA降解的酶。這也可能是miRNA介導Mrna衰減的一個重要途徑。3.2.2 miRNA介導的mRNA衰減（降解）4.microRNA應用現(xiàn)狀癌癥和發(fā)育中的miRNA3.1 miRNA功能的發(fā)現(xiàn)過去20年，腫瘤遺傳學家揭示了許多與腫瘤多步驟發(fā)生及進展相關的基因，這些研究都集中于傳統(tǒng)的蛋白質編碼基因，包括癌基因、抑癌基因以及維持基因組穩(wěn)定的基因。在發(fā)現(xiàn)miRNA之前，人們一直認為基因組上的部分大片段未被翻譯成蛋白質，所謂的“廢物碎片”沒有功能。而近十年來，越來越多的證據(jù)顯示，小分子

17、非編碼RNA-microRNA （miRNA或miR），其功能失調與腫瘤發(fā)生密切相關，證明了miRNA是基因表達強有力的調控器。證據(jù)： 基因組計算分析顯示約50000個miRNA存在于人類基因組中，每個miRNA在mRNA的3端非翻譯區(qū)的相同序列上都有著許多靶結合位點。在已發(fā)現(xiàn)的1400多個miRNA中，超過50%的miRNA位于癌癥相關的基因組區(qū)域內(nèi)，包括脆性位點，經(jīng)常發(fā)生缺失或復制的區(qū)域以及染色體易位的斷裂點。例如：miR-125b-1（一種線蟲microRNA lin-4的類似物）位于染色體11q24 區(qū)域，而這一區(qū)域在一些腫瘤病人（乳腺癌，肺癌，卵巢癌，宮頸癌等）中的表達常常缺失。So

18、noki等的研究認為，該基因與白血病的發(fā)生也有關系。越來越多的研究證實，這種長度約22nt的小分子RNA在植物和動物中廣泛存在，具有很廣泛的調控作用，是高等植物、動物生長發(fā)育的重要調節(jié)因子。植物miRNA最先于2002年由Reinhart等從擬南芥小分子文庫中獲得。 功能：調控植物形態(tài)建成、環(huán)境適應性、植物發(fā)育進程。3.1 miRNA功能的發(fā)現(xiàn)動物機體中miRNA影響胚胎干細胞和多種成體干細胞的發(fā)育、胚胎后期發(fā)育細胞生長和凋亡血細胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成及免疫系統(tǒng)的調控3.1 miRNA功能的發(fā)現(xiàn)3.2 miRNA在腫瘤診斷中的作用精確區(qū)分不同分化的腫瘤。 miRNA的表

19、達具有組織特異性，可將腫瘤與正常組織區(qū)分開，并可用于鑒定不明起源的腫瘤，找到原發(fā)灶，區(qū)分不同分化的腫瘤，以便進行腫瘤亞型的分類。識別腫瘤組織的來源。 特別是在臨床表現(xiàn)和免疫表型不確定的情況下，miRNA的作用顯得格外重要?？勺鳛榘l(fā)現(xiàn)早期腫瘤的非侵襲性分子標記，對腫瘤的診斷及分期有一定的意義。3.3 miRNA與腫瘤的發(fā)生miRNA在腫瘤形成過程中扮演著重要的角色，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，miRNA既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性，也可作為癌基因，下調抑癌基因的活性。作為抑癌基因，部分miRNA在腫瘤細胞中表達下調，當其功能缺失后可導致正常細胞發(fā)生惡性轉化。miRNA功能缺失的機

20、制包括染色體的缺失、突變、基因沉寂和(或)miRNA形成過程中的改變 。3.3.1 miRNA作為癌基因 在腫瘤中過表達的miRNA被認為是癌基因，并被稱“oncomirs”，它們常通過抑制抑癌基因和(或)控制細胞的分化以及凋亡促進腫瘤的生成。在多種不同的腫瘤中發(fā)現(xiàn)一些有意義的miRNA過表達，它們均具有癌基因功能。例如： 調節(jié)myc的miRNAmyc 是一個通過調控細胞增殖和死亡，從而調控細胞生長的轉錄因子。myc經(jīng)常在人類癌癥中突變或放大。miR-155是最早被提到的癌基因之一，位于人類21號染色體BIC基因的第3外顯子，此基因不含開放閱讀框，過表達可促進細胞異常增殖。在早期白血病形成中會

21、出現(xiàn)靶向性的B細胞過表達miR-155，且經(jīng)過成熟B細胞惡性轉化以后，導致白血病前B細胞單克隆性增殖的過程。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在乳腺癌、肺癌、結腸癌和甲狀腺癌中均有上調，是一個癌基因。 miRNA-21 在所分析的實體瘤（乳腺、結腸、肺、胃和內(nèi)分泌腺、惡性膠質瘤）中唯一表達的miRNA是miRNA-21。與正常組織相比， miRNA-21在癌組織中高水平表達，作為癌基因通過對Bcl2的調節(jié)來控制腫瘤的發(fā)生，并且可以作為治療的靶位點。例如：miR-15/miR-16 與慢性淋巴性白血病miRNA-15和miRNA-16定位于染色體13q14區(qū)段，該區(qū)段的局部丟失與慢性淋巴性白血病(C

22、LL相關)，在檢測的CLL病患中，有近68的這兩種miRNA完全缺失或表達下調。二者都在轉錄后水平通過靶向作用負調節(jié)Bcl-2，其對Bcl-2的抑制誘導了白血病細胞的凋亡。另外，在前列腺癌、外套淋巴細胞瘤和多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中也常有該區(qū)段的缺失。 注：Bcl-2蛋白是一種通過作用于線粒體來抑制細胞凋亡的蛋白，對于癌細胞的存活起著非常重要的作用。3.3.2 miRNA作為抑癌基因目前腫瘤中已完成表達分析及初步功能研究的部分miRNA3.4 miRNA在腫瘤治療中的作用miRNA的在體給藥局部腫瘤給藥。腫瘤內(nèi)給藥是目前miRNA在體給藥研究得最多的治療方式，在多個癌癥小鼠模型中，對腫瘤內(nèi)注射病毒包

23、裹的miRNA已經(jīng)成功地抑制了其生長。例如：將腺病毒包裹的miR-26a給藥到患有肝細胞癌的MYC誘導小鼠中，可有效抑制腫瘤細胞的生長并促進其凋亡。盡管直接注射藥物到特定組織、器官中可有效沉默目的基因，組織/器官的特異性及miRNA的半衰期仍然最終決定這些藥物的作用強度和時間，但現(xiàn)在已有多種在體腫瘤給藥的方式被證實有效。心血管給藥心血管給藥也是miRNA在體給藥研究得較早、較多的領域。在缺血后的心肌重建中miRNA常常發(fā)揮重要的作用。研究人員建立心梗小鼠模型，對其進行心肌內(nèi)注射腺病毒包裹的miR-24抑制劑，注射后發(fā)現(xiàn)miR-24表達減少在梗死周圍心肌細胞促進了血管生成和血流注減少了梗死區(qū)面積

24、，誘導了成纖維細胞的凋亡，一定程度上提高了心功能。肺部給藥滴鼻和吸入的方法是使藥物到達肺區(qū)的簡單、便宜、非侵入的方法。肺部支氣管、肺泡的結構，都可以直接接受大量細胞進入。肺部粘膜巨大的表面積，能快速發(fā)生反應，不會產(chǎn)生肝的首過消除效應，也使得局部給藥這種方法在肺部行之有效。通過氣管給藥，小分子RNA可以實現(xiàn)對哮喘、肺囊細胞纖維化、流感、呼吸道合胞病毒等肺感染性炎性疾病的治療。泌尿生殖系統(tǒng)給藥 miRNA類藥物可作用于多種泌尿道，生殖系統(tǒng)疾病。局部陰道m(xù)iRNA脂質體復合體給藥，在老鼠體內(nèi)表現(xiàn)出抑制靶基因和蛋白質的作用，有效地拮抗了單純性皰疹病毒。膀胱瘤移植小鼠在注射miR-1、miR-133、m

25、iR-218模擬物后，腫瘤的生長受到很好的抑制。另外，局部給藥還有皮膚、脊髓等方式，且針對miRNA的更多給藥方式相信不久后也會開展起來。目前來說，肺部給藥研究開展最多，有望最早進入臨床中，腦部給藥由于解剖上的血腦屏障仍需攻克許多難題。3.3 miRNA在癌癥預后判斷中的作用 Takamizawa等人報道指出，let-7 miRNA的表達往往在人肺癌中缺失，而let-7 miRNA表達的減少與術后生存期的減短顯著相關。此外，let-7 miRNA在A549肺腺癌細胞株中的過表達可在體外抑制肺癌細胞的生長。他們的研究結果表明了let-7 miRNA表達水平的改變具有潛在臨床和生物學作用。Yanaihara等