同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受

1、同種移植激活的宿主樹(shù)突狀細(xì)胞能介導(dǎo)免疫耐受作者:許奇齊，李玫，王松霞，薛殷彤1材料與方法1.1動(dòng)物雌性BALB/H2d，受者、雄性57BL/6H2b，供者和雄性129H2k，特異性對(duì)照供者鼠，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供，均為6周齡，全部的動(dòng)物都飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF-II級(jí)動(dòng)物房。1.2試劑硫酸新霉素和小鼠淋巴細(xì)胞分層液HISTPAQUER-1083購(gòu)自Siga-Aldrih，In公司。DynabeadsR小鼠panT(Thy1.2)磁珠標(biāo)記的抗體購(gòu)自Dynal，In.公司。PE標(biāo)記抗小鼠D4抗體，F(xiàn)IT標(biāo)記抗小鼠D8抗體由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系提供。DE和PBS由北京大學(xué)人民

2、醫(yī)院提供。1.3激活并分選宿主樹(shù)突狀細(xì)胞為激活宿主樹(shù)突狀細(xì)胞Ds，在分選細(xì)胞前的第天，給BALB/宿主動(dòng)物行同種異體皮膚移植，皮片供者為57BL/6鼠。然后于收獲細(xì)胞的當(dāng)天處死這些BALB/宿主動(dòng)物，取它們的脾臟，通過(guò)HISTPAQUER-1083小鼠淋巴細(xì)胞分層液離心分層收獲單核細(xì)胞，再使用DynabeadsR小鼠panT(Thy1.2)磁珠抗體通過(guò)陰性分選去除小鼠Thy1.2陽(yáng)性的細(xì)胞，最終得到含激活Ds的小鼠脾細(xì)胞，用DE調(diào)整細(xì)胞濃度到3.0107ells/l。1.4宿主骨髓細(xì)胞分選用注射器使用DE沖洗BALB/宿主動(dòng)物的股骨和脛骨骨髓腔，搜集細(xì)胞，離心洗滌一遍，然后用DE調(diào)整細(xì)胞濃度到

3、5.0106ells/l。1.5受者動(dòng)物的準(zhǔn)備在承受皮膚移植前的第天，BALB/受者首先承受900rad致死量的伽瑪射線照射，射線源為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部鈷-60照射室，然后于照射后的h內(nèi)，每只BALB/受者，通過(guò)尾靜脈，或者輸入1.0106骨髓細(xì)胞，或者輸入1.0106骨髓細(xì)胞和5.0106激活的宿主Ds細(xì)胞的混合細(xì)胞。1.6移植和耐受誘導(dǎo)在回輸細(xì)胞后的第天，不同處理的BALB/受者給予同種異體皮片移植，取自小鼠尾巴的皮膚剪裁成大小為0.90.9的皮片11，如表所示，承受來(lái)自57BL/6鼠的皮片的動(dòng)物作為耐受誘導(dǎo)組，承受來(lái)自129鼠的皮片的動(dòng)物作為特異性對(duì)照組。1.7病理組織學(xué)分析于空白對(duì)照組排擠

4、的時(shí)間，即皮片移植后第天取材，取材部位是移植皮片及其周邊范圍內(nèi)的皮膚組織，在北京大學(xué)干細(xì)胞中心處做石蠟切片，HE染色，光鏡分析。1.8流式細(xì)胞分析分別于皮片移植術(shù)后第、天取移植受者外周血，溶解紅細(xì)胞后，使用標(biāo)記抗小鼠D4抗體和標(biāo)記抗小鼠D8抗體，雙標(biāo)直染；然后使用FASan(BetnDikinsn)行流式細(xì)胞分析外周血D4+或者D8+T細(xì)胞以及兩者的比例。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS軟件，使用配對(duì)檢驗(yàn)來(lái)比擬各組間皮片存活時(shí)間差異，P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1致死量照射后宿主動(dòng)物的免疫造血功能重建實(shí)驗(yàn)組受者動(dòng)物BALB/鼠在移植前30天，首先給予致死量伽瑪射線900rad照射，同時(shí)在6

5、h內(nèi)通過(guò)尾靜脈混合回輸激活的Ds去除T細(xì)胞的脾細(xì)胞和同基因骨髓細(xì)胞，或者僅回輸同基因骨髓細(xì)胞；隨后受者動(dòng)物將開(kāi)場(chǎng)免疫造血功能重建。30天后進(jìn)展小鼠尾部皮片移植供者分別為57鼠和特異性對(duì)照129鼠。在照射后的3個(gè)月的觀察期間，各組動(dòng)物均存活良好。2.2承受回輸激活的Ds的移植模型中，皮片存活時(shí)間延長(zhǎng)如表1所示，不同分組間，皮片存活時(shí)間存在明顯差異。其中，組0為受者未承受任何特殊處理，直接行皮片移植的結(jié)果，其皮片中數(shù)存活時(shí)間ST為11天；組1為受者經(jīng)致死量伽瑪射線照射后給予激活的Ds和同基因骨髓細(xì)胞經(jīng)免疫造血功能重建30天后，行皮片移植的結(jié)果，ST=20天；兩者相比，組1受者皮片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為差異有顯著性P0.005。圖1為第11天組0左和組1右的移植皮片的照片，組0受者的移植皮片完全被排擠脫落，而組1的皮片存活良好；圖2為組1受者移植皮片第15(A)，17(B)，19()，21(D)，23(E)天的照片，可見(jiàn)第21天前皮片均生長(zhǎng)良好，第23天時(shí)皮片顏色加深，出現(xiàn)邊緣結(jié)痂，排擠的跡象。圖1為第11天組0左和組1右的移植皮片的照片，組0受者的移植皮片完全被排擠脫落，而組1的皮片存活良好表1受者動(dòng)物給予不同處理后行同種皮片移植、皮片存活時(shí)間統(tǒng)計(jì)表注：受者鼠在皮片移植前天給予900rad致死量伽瑪射線照射，同時(shí)如表1所示，于照射后h內(nèi)回輸不同的細(xì)胞。表中的計(jì)算基于次不同的實(shí)驗(yàn)

7、結(jié)果；*P0.005組和組間；P0.0001組和組間。ST，edianSurvivalTie，即中數(shù)存活時(shí)間。D，指經(jīng)同種移植激活的樹(shù)突狀細(xì)胞，即BALB/小鼠先承受同種皮片移植供者為57鼠，10天后取脾細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分層離心得到單核細(xì)胞，并用磁珠標(biāo)記的抗小鼠pan-T抗體陰性分選去除細(xì)胞后得到的細(xì)胞。B，為同品系的BALB/小鼠骨髓細(xì)胞2.3激活的D細(xì)胞誘導(dǎo)供者特異性移植耐受為證實(shí)激活的D細(xì)胞誘導(dǎo)的是供者特異性的耐受，我們?nèi)o(wú)關(guān)的供者129鼠的尾部皮片，如表1組3所示，與組1相比，受者的處理完全一樣，但皮片來(lái)自無(wú)關(guān)的129鼠，該移植皮片在第10天均被完全排擠，ST=10天，與組1相比

8、，差異有顯著性P0.001。相反，供者照射后僅給予骨髓細(xì)胞，產(chǎn)生的耐受是非特異性的，如組2、組4所示，受者對(duì)57鼠和129鼠的皮片均產(chǎn)生耐受，兩者ST均到達(dá)28天，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05。2.4移植皮片部位病理組織學(xué)分析如圖3所示，第11天，組0(A)，組3受者皮片完全被排擠，鏡下觀察見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組0(A)皮片和受者移植部位相別離；相反，此時(shí)組1(B)皮片生長(zhǎng)良好，鏡下見(jiàn)移植皮片和受者移植部位沒(méi)有脫離傾向，也未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。2.5實(shí)驗(yàn)組的免疫學(xué)功能狀態(tài)的流式細(xì)胞分析結(jié)果分別于皮片移植術(shù)后第11、19、23天，取組0、組1移植受者外周血，用流式細(xì)胞分析外周血D4+或者D8+T細(xì)

9、胞以及兩者的比例。如表2所示，于第11天，組0和組1間，D4+、D8+細(xì)胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，D4+、D8+細(xì)胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性P0.01?？梢?jiàn)在免疫重建過(guò)程中，組1的D4+輔助性T細(xì)胞于移植后30天，在比例和絕對(duì)數(shù)目上已經(jīng)完全恢復(fù)；從D4+/D8+細(xì)胞比值看，骨髓移植后，比值明顯升高了，一方面是D4+的T細(xì)胞比例增加了，同時(shí)，D8+T細(xì)胞比例減少了，D8+的T細(xì)胞減少的幅度超過(guò)了D4+的T細(xì)胞增加的幅度，結(jié)果D4+/D8+的比值，組1與組0相比，增加了3倍左右。在完全排擠的23天，其值到達(dá)最頂峰7.87。表2流式細(xì)胞分析結(jié)果注：于第11

10、天，組0和組1間，D4+、D8+細(xì)胞以及兩者的比例差異有顯著性；第11、19、23天，D4+、D8+細(xì)胞以及兩者的比例在組1受者組內(nèi)差異也有顯著性3討論皮膚移植是非常嚴(yán)格的移植排擠動(dòng)物模型，皮膚是全身各種器官組織中最容易被排擠的組織，而且皮膚移植直觀，操作相對(duì)簡(jiǎn)單11，所以我們選擇它作為動(dòng)物模型。在不使用系統(tǒng)性免疫抑制劑的情況下，我們?cè)谛∈笃つw移植模型中成功誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受，使皮片存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，對(duì)于57BL/6來(lái)源的皮片，其ST達(dá)20天；相反，對(duì)于無(wú)關(guān)129鼠來(lái)源的皮片，其ST=10天。可能的耐受機(jī)制是復(fù)雜的：1可能是由于經(jīng)同種移植激活的Ds攜帶供者特異性抗原，經(jīng)尾靜脈回輸進(jìn)入受鼠體

11、內(nèi)，然后隨血液循環(huán)歸巢到受者胸腺中，提呈供者抗原參與陰性選擇過(guò)程，使受者在免疫重建過(guò)程中，大部分供者反響性的T淋巴細(xì)胞在胸腺程度經(jīng)陰性選擇由誘導(dǎo)凋亡克隆去除和克隆無(wú)能等機(jī)制去除掉，從而誘導(dǎo)對(duì)供者皮片的耐受，同時(shí)，在免疫重建的過(guò)程中，受者能保持對(duì)其他抗原的正常免疫應(yīng)答；2也可能是供者抗原進(jìn)入胸腺后，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg細(xì)胞對(duì)供者產(chǎn)生特異性的免疫耐受。3還可能是由于同種移植激活的Ds攜帶供者特異性抗原進(jìn)入體內(nèi)后，激活同種反響性T細(xì)胞回流入胸腺所致。從組3的結(jié)果可知，承受了致死量照射的受鼠在經(jīng)過(guò)30天的免疫重建后，于第10天就完全排擠了無(wú)關(guān)129鼠的皮片，一方面說(shuō)明該耐受誘導(dǎo)方案的特異性；同時(shí)也

12、說(shuō)明，受鼠具備了完好的免疫功能，流式細(xì)胞分析的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了受鼠的免疫功能，如表2所示，在免疫重建過(guò)程中，組1的D4+輔助性T細(xì)胞于移植后30天，在比例和絕對(duì)數(shù)目上已經(jīng)完全恢復(fù)；從D4/D8細(xì)胞比值看，由于外周D4/D8的比值是由胸腺的微環(huán)境決定的，胸腺的輸出對(duì)于該比值有決定性的影響，在正常的成年小鼠，其值介于24之間12；骨髓移植后，比值明顯升高了。由于D4+的細(xì)胞識(shí)別HlassII分子和外源性的抗原肽形成的復(fù)合體，因此推斷可能是由于同種激活的Ds攜帶同種異型抗原分子進(jìn)入胸腺后，一方面通過(guò)胸腺的陰性選擇誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的D8+T細(xì)胞凋亡，因此外周D8+T細(xì)胞的比例減少了近一半；同時(shí)，由于該方案誘導(dǎo)的是不完全的耐受，其ST=20天，移植術(shù)后不可防止的發(fā)生排擠反響，將導(dǎo)致了D4+的T細(xì)胞數(shù)目增加，在完全排擠的23天，其值到達(dá)最頂峰。皮膚移植有高排擠性且操作簡(jiǎn)單，是良好的移植動(dòng)物模型，但是在臨床上多為自體皮膚移植，因此，我們也設(shè)想在今后的實(shí)驗(yàn)中嘗試心臟移植、腎臟移植等其