細胞毒性試驗總結

1、細胞毒性實驗總結 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 抗HBV藥物細胞毒性實驗背景知識 1 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 細胞毒性實驗方案的確立 3 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 細胞毒性實驗方法穩(wěn)定后的部分數(shù)據(jù) 4 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 細胞毒性實驗質量評價指標 5 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 細胞毒性

2、實驗 SOP6（一）目的6 HYPERLINK l bookmark15 o Current Document （二）適用范圍6 HYPERLINK l bookmark17 o Current Document （三）責任人6 HYPERLINK l bookmark19 o Current Document （四）規(guī) 程6試驗準備7試驗操作8數(shù)據(jù)處理和分析8 HYPERLINK l bookmark21 o Current Document 總結9一、 抗HBV藥物細胞毒性實驗背景知識細胞毒性是化學物質（藥物）作用于細胞基本結構和/或生理過程，如細胞膜或細胞骨架結構，細胞的新陳代謝過程，細

3、胞組分或產物的合成、降解或釋放，離子調控及細胞分裂等過程， 導致細胞存活、增殖和/或功能的紊亂，所引發(fā)的不良反應。按作用機制可分3種類型：基本細胞毒性，涉及一種或多種上述結構或功能的改變，作用于所有類型的細胞；選擇細胞毒性， 存在于某些分化細胞上，主要通過化學物質的生物轉化，與特殊受體結合或特殊的攝入機制所 引發(fā)；細胞特殊功能毒性，對細胞結構和功能損傷輕微，但對整個機體損傷非常嚴重。類似 毒性作用可通過細胞因子、激素和遞質的合成、釋放、結合和降解影響細胞與細胞間的交流或 特殊的轉運過程而實現(xiàn)。毒性作用也可能來自化學物質對細胞外過程的干擾，任何一種非動物檢測系統(tǒng)對多種因素都應加以考慮。1983年

4、Ekwall提出 基本細胞功能”的概念，即多數(shù)化學物質毒性作用是對細胞功能的非特異性損傷，卻可引起器官功能的特異性改變甚至機體死亡。有 研究顯示化學物質體外細胞毒性與其引起的動物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間都存在良好 的相關性?；瘜W物質產生的損傷和死亡，最終可表現(xiàn)為細胞水平上的改變，由此推測體外細胞 毒性可以預測體內急性毒性。體外方法有助于預測化學物質急性暴露引發(fā)的全身和局部影響， 并評估體內毒性濃度。目前較為理想的抗 HBV藥物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韋（ETV）等。3TC是核昔左旋 對味體，早期用于艾滋病的治療。 拉米夫定體外能才制艾滋病毒1、2型及乙型肝炎病毒逆轉錄酶，在人淋巴細胞

5、和單核細胞內抑制艾滋病毒逆轉錄酶活性，在 HBV-DNA轉染的人肝癌細胞 內有抑制HBV-DNA復制，在HBV感染黑猩猩體內有抑制病毒作用。拉米夫定作用原理是藥物進入細胞器，為細胞脫氧胞喀咤激酶和細胞激酶磷酸化為活性5-三磷酸拉米夫定，競爭性抑制依賴于病毒 DNA和RNA逆轉錄酶。恩替卡韋（ETV）為環(huán)氧羥碳脫氧鳥昔，具有較強的抗 HBV作用，也可抑制拉米夫定引起的YMDD變異病毒株感染。在體外應用HBV DNA轉染的HepG2細胞作藥敏試驗， 結果該藥抗HBV作用最強。恩替卡韋？拉米夫定？泛昔洛韋抑制 HBV 的半數(shù)有效濃度（EC50）分別為0.00375 mol/L 0.116科mol/L

6、（文獻報道多在幾 nM到幾個 眼, 范圍較寬）、100科mol/L在土撥鼠肝炎病毒（ WHV）感染的土撥鼠動物模型，口服恩替卡韋 0.1 mg/kg.d共12周，血清 WHV轉陰。以后，每周口服 0.1 mg/kg ,血清 WHV仍維持陰性。因 此3TC和ETV常被用作抗HBV藥物篩選時的陽性對照藥，用來評價篩選系統(tǒng)的正常與否。3TCETV通常的做法是：將不同濃度的3TC加入到培養(yǎng)的細胞中，作用一定時間后檢測藥物對細胞的毒性。檢測方法有 MTT法、XTT法、熒光檢測法等。其中 MTT法和XTT法原理相同，由 于其方法簡單快速，不需特殊的儀器設備，因此得到了廣泛應用。MTT法是二十世紀八十年代發(fā)

7、展起來的一種快速、簡便的測試方法，目前已被廣泛用于藥物體外篩選實驗。MTT法是一種檢測細胞活性的方法。與以往細胞水平研究中檢測細胞活性的兩種常規(guī)方法-細胞計數(shù)法和同位素摻入法相比，MTT法具有操作簡便、快速、準確、廉價及不使用同位素等優(yōu)點，已廣泛應用于生物醫(yī)學的諸多領域。同時，MTT法也是FDA及我國藥品審批部門推薦的檢測方法之一。其基本原理如下：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠還原黃色的澳化3-（4,5- 二甲基曝陛-2）-2,5- 二苯基四氮陛3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide , MTT為藍紫色的不溶于水的

8、甲月贊（formazan）,甲月贊的生成量在通常情況下與活細胞數(shù)成正比。由于甲月費的多少可通過酶標儀測定其在570nm處的吸光度（OD值）而得知，因此可根據(jù)OD值推測出活細胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷細胞的能力。目前已有 MTT的升級替代產品，如 XTT、MTS、WST-8等，三種方法的比較見下表。盡管CCK-8方法簡便、準確、靈敏度高，但比MTT的價格要貴不少，所以一般來說，還是 MTT法用的多。三種方法的比較MTT法XTT法CCK-8 法（WST-8法）甲月贊水溶性難溶性水溶性水溶性檢測波長490 nm450nm450nm性狀粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用毋需頂制使

9、用有機溶劑DMS誠其它溶劑一一方便性+檢測速度+重復性+穩(wěn)定性+工作量-對細胞毒性-對人體毒性一-二、細胞毒性實驗方案的確立在確定MTT法作為細胞毒性實驗的方法之后， 我們對實驗中可能涉及的各個參數(shù)進行了摸 索和優(yōu)化。最初，由于一切都是未知，因此常常幾個參數(shù)一起調整，使得各個參數(shù)對結果的影 響不是很清楚，走了一些彎路。后期逐漸摸清了參數(shù)對結果影響的權重，實驗方案逐步確立?？紤]的實驗參數(shù)有： 細胞批次、細胞密度、孵育時間、加藥次數(shù)、MTT量、MTT孵育時 間、DMSO溶解時間（振蕩時間）等 。parameterCC50cell density2000/well, 5000/well, 10000

10、/well,40000/wellseeding time1d/2dincubation time7d/10dFBS10%, 2%, 0.5%volume100 山 150d , 180 d經過實驗，最終將實驗參數(shù)確定如下:parameterCC50cell density5000/wellseeding time1dincubation time7dFBS2%volume1804其中，孵育時間采用 7天，主要是希望縮短篩選周期，10天也取得了較好的結果。培養(yǎng)基體積對結果影響不大。采用180 M主要是和DNA增殖抑制實驗保持一致。三、細胞毒性實驗方法穩(wěn)定后的部分數(shù)據(jù)在細胞毒性實驗方案穩(wěn)定之后，在

11、各孔吸光度的標準差、變異系數(shù)和各孔抑制率的標準差 都可以控制在很低的水平，表明該實驗方案是穩(wěn)定的，具有良好的重現(xiàn)性。Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.(uM)Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.

12、(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV20020.2150.0178.01911.6410.1601000.3690.0215.73620.0110.493500.8580.0252.91146.5292.720251.2270.13510.96766.5409.9491.4800.0674.50480.2780.3201.6200.0684.17987.8340.0511.7400.0522.98994.3420.05701.8440.0422.251100.0000.000典型ETV的CC50實驗數(shù)據(jù)0.25 0.5 I 2

13、J r IB 那國 12S 期 M2 1口？4 的43ETV (UM)典型3TC的CC50實驗數(shù)據(jù)Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc.(uM)value1value2Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc

14、.(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV80000.2090.03918.81511.7961.9024000720.0193.23832.3351.73920000.8420.0505.99447.5984.99010001.3070.0151.11173.8843.0565001.5880.0342.16689.7684.9662501.6480.0090.52993.1602.7951251.7100.0613.57196.6460.24101.7690.0170.934100.0000.000川SOcompound 3TC

15、 cell density 5x103 Incubation lime 7 drug addin* times 2% FBSrate=i CC50=2i30uM3254126250512 1QZ4 204-6 40915 192 16334 327003TC uM四、細胞毒性實驗質量評價指標對細胞毒性進行質量評價白指標初步定為以下7個：. OD平均值：反映復孔間 OD值的平均水平，OD值越大，細胞數(shù)越多。.復孔OD值間的標準差（STDEV）:反映各復孔 OD值之間的離散情況。標準差越大， 說明復孔間不平行性越大，操作誤差越大。.復孔OD值間的變異系數(shù)（CV）:也是反映復孔間 OD值離散情況的指

16、標。由于 OD 值間的標準差（STDEV ）的單位和OD的單位是一致的，不能體現(xiàn)離散的權重，因此 引入變異系數(shù)（CV）。這一指標以百分比的形式表現(xiàn)OD值的離散情況，形象、直觀。.存活率（% Viability ）：計算各藥物濃度下細胞的存活率可以反映細胞存活情況，該值 越大，說明藥物的細胞毒性作用越小。.存活率的標準差（ STDEV ）:該值反映如以每個復孔均作為單獨的實驗，則同批的 復孔可以看作數(shù)批實驗， 此時存活率的分布情況。 該指標越大，說明復孔間越不平行。.存活率的變異系數(shù)（ CV）:該指標反映各復孔間存活率的離散情況，該值越大，說明說明每一列細胞孔（即一系列稀釋單孔）間不平行性越大。

17、. 半數(shù)致細胞毒性濃度（concentration of cytotoxicity 50% , 0050）:指對半數(shù)細胞產生 毒性作用所需濃度。該指標可用來反映實驗系統(tǒng)是否正常工作及評價未知藥物對細胞 的毒性。五、細胞毒性實驗SOP化合物抗HBV活性細胞毒性實驗標準操作規(guī)程（MTT法）（一）目的使實驗操作標準化，保證正常工作的進行。（二）適用范圍本標準適用于 MTT法檢測抗HBV藥物細胞毒性的操作及計算0050 o（三）責任人分子生物學組操作人員對本規(guī)程負責。（四）規(guī)程術語：0050 （ concentration of cytotoxicity 50 %）:半數(shù)細胞毒性濃度，指對半數(shù)細胞產生

18、毒性作 用所需濃度。在本實驗中，指致50%細胞死亡所需的藥物濃度。本實驗旨在通過 MTT法檢測未知化合物對轉染了HBV基因組的細胞系HepG的細胞毒性。背景知識：MTT法是二十世紀八十年代發(fā)展起來的一種快速、簡便的測試方法，目前已被廣泛用于藥物體外篩選實驗。其基本原理如下：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠還原黃色的澳化3-（4,5-二甲基曝口坐-2）-2,5-二苯基四氮口坐3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide, MTT為藍紫色的不溶于水的甲月贊（formazan）,甲月贊的生成量在通常情況下與活細胞數(shù)成正比。由于甲

19、月費的多少可通過酶標儀測定其在570nm處的吸光度（OD值）而得知，因此可根據(jù) OD值推測出活細胞的數(shù)目，了解藥物抑制或殺傷細胞的能力。MTT法是一種檢測細胞活性的方法。與以往細胞水平研究中檢測細胞活性的兩種常規(guī)方法-細胞計數(shù)法和同位素摻入法相比，MTT法具有操作簡便、快速、準確、廉價及不使用同位素等優(yōu)點，已廣泛應用于生物醫(yī)學的諸多領域。同時， MTT法也是FDA及我國藥品審批部門推薦 的檢測方法之一。試驗準備試劑和耗材：試劑：胎牛血清（FBS） ; G418; DMEM 培養(yǎng)基（高糖）； 0.25%Trypsin-EDTA ;磷酸 鹽緩沖液（無車鎂）； DMSO ;耗材：0.2針頭過濾器（有

20、機相和水相）；1 ml和10 ml注射器；96孔細胞培養(yǎng)板；移液管（5 ml、10 ml）;移液器Tip頭。溶液配制：完全培養(yǎng)基：DMEM和FBS按9 ： 1 （體積比）混和，并添加1/1001/50 （體積比）的hepes 和終濃度為380回/ml的G418。維持培養(yǎng)基：DMEM和FBS按49： 1 （體積比）混和，并添加 1/1001/50 （體積比）的 hepe環(huán)口終濃度為3800ml的G418。磷酸鹽緩沖液（無鈣、鎂）：8 g/L NaCl ,0.2 g/L KCl , 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH 2P。4, pH7.4,高壓蒸汽滅菌121c 20 mi

21、n, 4c保存。（注意：實際配制時，有些試劑含多個 分子的水，需將該部分的質量算進去。）細胞培養(yǎng)：HepG培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基，于 37 C, 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種時，細胞 密度控制在1X105/ml2X105/ml左右。細胞計數(shù)：見附件細胞計數(shù)。細胞鋪板：細胞計數(shù)后，用完全培養(yǎng)基稀釋成M04 ml,在5%CO2, 37c培養(yǎng)24 h備用。注意：在向96孔細胞培養(yǎng)板中接種細胞時，應注意每次吸取細胞懸液前，都應輕輕搖勻，盡量減少每次吸取的細胞數(shù)目的差異。將藥物用少量DMSO溶解，并用0.2科訂次性針頭過濾器（有機系）過濾除菌，此為母液 （其濃度通常為預先設計的最高待測濃度的1000倍或以

22、上）；然后用維持培養(yǎng)基將母液稀釋到實驗預先設計的最高待測濃度。如配制的母液體積過?。ㄈ绲陀? ml）,不便于過濾，可先用完全培養(yǎng)基將其稀釋到最高待測濃度，再用0.2科廠次性針頭過濾器（水系）過濾后分裝備用。試驗操作藥物稀釋：藥物采用倍比稀釋?？稍?EP管中稀釋。第一管為最高待測濃度的藥液。自第二管分別加入一定量的維持培養(yǎng)基，然后從第一管吸取等量的藥液至第二管，吹打混勻后,棄去tip頭并換新tip頭，從第二管吸取等量藥液至第三管，吹打混勻。依此操作直至倒數(shù)第二管。最后一管為維持培養(yǎng)基，不含藥物。藥物處理：棄去細胞培養(yǎng)液，注意吸除干凈。然后吸取已稀釋的藥液180出睢IJ對應的細胞孔中。各濃度組均設三孔重復，最后一排孔為細胞對照。另設培養(yǎng)基對照。如圖1。加藥后在5%CO2, 37c細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h;按上述步驟換新鮮含藥培養(yǎng)基，共2次。最后一次換藥后再培養(yǎng) 72 h,準備檢測。00000000 00000000 。 ooeoeeeo 。 。 。 oeeeeeeo ooooooeo 00000000圖1黃色部分為PBS,無細胞；綠色為培養(yǎng)基對照；粉色、藍色部分為兩種不同的藥物處理，每種藥物設三個重復，8個濃度，紅色部分為細胞空白對照。MTT檢測：將MTT母液（5mg/ml , 10X）用PBS稀釋為1 X）。去除各孔中的培養(yǎng)液（注 意：盡可能去除干凈?。?，加入 1XMTT, 2