基于核酸擴(kuò)增的腹瀉多病原檢測程 序的建立與評價

1、基于核酸擴(kuò)增的腹瀉多病原檢測程 序的建立與評價感染性腹瀉是重要的全球性公共衛(wèi)Th問題之一。每年大約有20-40億腹瀉病例，5歲以下兒童發(fā)病率更高。中國報告病例數(shù)與實(shí)際發(fā)病水平相差甚大。數(shù)據(jù)來源：中國CDC法定傳染病報告確診病 例采樣檢測就診患者傳染病監(jiān)測金字塔疾病流行程度的估算疾病負(fù)擔(dān)測算難進(jìn)行的監(jiān)測癥狀監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)直報實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測腹瀉病監(jiān)測的難點(diǎn)病原體復(fù)雜多樣 （病毒、細(xì)菌、寄Th蟲）相似癥狀：腹瀉為主要癥狀臨床診斷無法確定感染類型實(shí)驗(yàn)室檢測難度大合計892578合計170752實(shí)驗(yàn)室 診斷17075219確定病原6144436臨床診 斷71570080無信息10930864疑似61110.68數(shù)

2、據(jù)來源：中國CDC衛(wèi)Th應(yīng)急中心病毒90%細(xì)菌10%標(biāo)本中細(xì)菌載量、病原菌/正常細(xì)菌的Th長競爭 抑制操作繁瑣，依靠實(shí)驗(yàn)人員的主觀判斷不能大量處理標(biāo)本缺乏有效的富集和選擇性培養(yǎng)條件抗Th素致細(xì)菌死亡金標(biāo)準(zhǔn)，耗時耗力高通量，高成本，難推廣靈敏，快速，需發(fā)展最優(yōu)方案 10種腹瀉病原:5種細(xì)菌,5種病毒:致瀉性大腸桿菌,沙門菌,志賀菌,霍亂弧菌,副溶血性弧菌,星狀病毒,腺病毒,諾如病毒,輪狀病毒,札如病毒腹瀉門診病例 2013年4-12月5家醫(yī)院，濱湖，惠山，錫山病毒：核酸檢測。細(xì)菌：分離培養(yǎng)和核酸檢測比較，確 證實(shí)驗(yàn)哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉標(biāo)本增菌富集接種選擇性培養(yǎng)基基于核酸擴(kuò)增的腹瀉 多病原檢測程序目標(biāo)菌分

3、離 鑒定單重?zé)晒釶CR 檢測腹瀉病毒多重?zé)晒釶CR和多重 常規(guī)PCR檢測目標(biāo)菌兩種方法不同環(huán)節(jié)檢 測結(jié)果匯總和比較， 不一致結(jié)果測序確認(rèn)腹瀉病原譜（目標(biāo)菌+目標(biāo)病毒）提取核酸提取核酸毒力基因、 耐藥譜技術(shù)路線腹瀉病原體檢測流程單重?zé)晒釶CR檢測NV,RV,ASTV,SV,EADV雙重?zé)晒?PCR檢測沙 門菌雙重?zé)晒釶CR 檢測弧菌腹瀉標(biāo)本SBG增菌藥敏試驗(yàn)、 毒力基因Cary Blair運(yùn)送培養(yǎng)基直接接種XLD、EMB沙門菌顯色 培養(yǎng)基沙門菌可疑菌落Th化鑒 定、血清分型志賀菌APW增菌弧菌顯色培養(yǎng)基多重常規(guī)PCR 鑒定毒力基因可疑菌落Th化鑒 定、血清分型可疑菌落Th化鑒 定、血清分型可疑菌

4、落Th化 符合大腸桿菌、 血清分型致病性弧菌DEC多重常規(guī) PCR檢測 DEC雙重?zé)晒釶CR檢測沙門菌/ 志賀菌和副溶血性弧菌/霍 亂弧菌，多重常規(guī)PCR檢測DECPrevalence of bacteria目標(biāo)基因目標(biāo)菌Salmon ellaompC長度擴(kuò)增參數(shù)204序列（5-3）F:ATCGCTGACTTATGCAATCGR:CGGGTTGCGTTATAGGTCTGvirAF:CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA94 5min ； 94 30 s，5430s，7230 s，30個循環(huán)。725215 min 。Shigell aR:TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCT

5、CCrrs40194 5min ； 94 30 s，5760s，7230 s，30個循環(huán)。721 0min。ipaH619DECstx1370stx2283eaeA482aggR254F:CCC CCT GGA CGA AGA CTG AC R:ACC GCT GGC AAC AAA GGA TAF:GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA TAC CGT C R:GCC GGT CAG CCA CCC TCT GAG AGT ACF:AAA TCG CCA TTC GTT GAC TAC TTC T R:TGC CAT TCT GGC AAC TCG CGA TGC A F:

6、CAG TCG TCA CTC ACT GGT TTC ATC AC R:GGA TAT TCT CCC CAC TCT GAC ACC F:TCA ATG CAG TTC CGT TAT CAG TT R:GTA AAG TCC GTT ACC CCA ACC TGF: GTA TAC ACA AAA GAA GGA AGC R: ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC F:TCT CTA TGT GCA TAC GGA GC R:CCA TAC TGA TTG CCG CAAlt322確證實(shí)驗(yàn)PathogensCultrueSalmonella18PCR of stool s

7、amples+Confirmed + 11PCR of enriched samples+Confirmed + 2222Shigella2884a4DEC618132121V. parahaemolyticus22NDb2NDV. cholerae21ND2NDTotal303051Summary of the detection resultsa positive results from Shigella broth, 122 specimens from August to Octoberb not detected.CultruePCR of stool samplesPCR of

8、enriched samplesDEC21143175161312P0.07070.0003Salmonella11718003164312P.00010.0455Shigella201063263118P0.01430.0833Comparison of the detection resultsbetween PCR-based methods and culture/isolation method.By PCRBy cultureTotalpathogenDirectPost proliferationpositivenumberPositiveSensitivitySpecifici

9、tyPositiveSensitivitySpecificityPositiveSensitivitySpecificitySalmonella14.5%100.0%22100%100.0%1881.8%100.0%22Shigella8100%100.0%4a100.0%100.0%225.0%100.0%8DEC1846.4%98.4%2175%100.0%621.4%100.0%28V.paraha emolyticu2s100%100.0%2100%100.0%2100%100.0%2V.cholerae150.0%100.0%2100%100.0%2100%100.0%2Sensit

10、ivity and specificity of different methods for different pathogens標(biāo)本號Ct分離增菌后5-62716副溶血性弧菌7-352912副溶血性弧菌標(biāo)本號分離增菌前7-59-霍亂弧菌11-28281514霍亂弧菌標(biāo)本號Ct分離增菌前增菌后8-1221178-SH642823志賀菌9-8221710-11271811-3329/11-4035/志賀菌C1t1-5026/增菌后12-423/ 增菌前增菌后熒光PCR Ct值變化不同菌檢測方法的改善針對沙門菌、直接使用糞便標(biāo)本提取核酸的檢測，因?yàn)榧S 便標(biāo)本中的核酸擴(kuò)增抑制因素和目標(biāo)菌量少，導(dǎo)致

11、檢測效率 很低，甚至遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于增菌后培養(yǎng)。志賀菌增菌肉湯的增菌效果并不明顯。直接對標(biāo)本進(jìn)行熒 光PCR篩查，檢出率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。1、多重PCR方法來進(jìn)行平行檢測比較，能同時檢測五類致 瀉大腸桿菌。2、糞便標(biāo)本中直接提取核酸進(jìn)行擴(kuò)增時，得到了較多的假 陽性結(jié)果。挑取培養(yǎng)平板第一區(qū)檢測，基本消除了糞便中的 核酸擴(kuò)增抑制因素，使靈敏性和特異性均提高。3、從第一區(qū)分離獲得目標(biāo)細(xì)菌仍較困難。致病性弧菌，增菌后Ct值明顯變小，平板上基本全是目標(biāo) 菌，提示APW增菌作用明顯。樣本數(shù)太少，僅推測。方法耗時成本(元/份）操作性直接檢測增菌后檢測常規(guī)分離培養(yǎng)3-5d3-5d30繁瑣核酸檢測3-5h8-10h80

12、簡單檢測耗時、成本和操作性比較檢測通量：常規(guī)分離培養(yǎng)：每個標(biāo)本進(jìn)行多管増菌、多個平皿劃線培養(yǎng)，每個 平皿挑選多個菌落整合PCR核酸檢測：同時對多份標(biāo)本提取核酸檢測，一個體系檢測 幾種病原，陰性標(biāo)本終止實(shí)驗(yàn)，陽性標(biāo)本根據(jù)核酸陽性目標(biāo)病原進(jìn) 行檢測病原譜特征標(biāo)本總體情況2013年4月-12月共采集腹瀉標(biāo)本334份。其中5歲以下兒 童病例32例，占總量的9.6%。流行曲線1、病毒性腹瀉在冬春季呈現(xiàn)更高的陽性率。陽性率由高到低： NV （11.7%）， RV（8.4%），Adv（2.1%），Astv（1.5%），Eadv（1.2%）。5種病毒檢出率 24.9%。NV和RV在5歲以下兒童中陽性率與其他年齡組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2、細(xì)菌性腹瀉夏季流行，沙門菌和致瀉性大腸桿菌在5歲以下兒童和其他年齡組 分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3、增菌后檢測陽性率（16.5%)高于分離培養(yǎng)(9.0%)。2010-2012年監(jiān)測情況（細(xì)菌）：7.4 ，3.8 ，1.5 ?；旌细腥靖篂a病原構(gòu)成比沙門菌血清型呈現(xiàn)多樣性，18株菌分布于5個血清群，腸炎沙門菌為優(yōu)勢菌。沙門菌對多種抗Th素耐藥，對四環(huán)素和萘啶酸耐藥程度高。 志賀菌1株為宋內(nèi)相，1株為福氏2a。致瀉性大腸桿菌5株產(chǎn)ST毒素，1株產(chǎn)LT毒素。對萘啶酸和甲氧芐啶/ 磺胺甲噁唑的耐藥程度較高。霍亂弧菌均為非O1非O139群血清型，不產(chǎn)霍亂毒