人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒體外制備分離方法的實(shí)驗(yàn)研究

1、人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒體外制備別離方法的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】設(shè)計(jì)一種體外制備、別離人工關(guān)節(jié)金屬磨損顆粒的方法，并驗(yàn)證這種顆粒用于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。方法用鈦鋁釩合金、鈷鉻鉬合金材料分別制成球磨罐(國(guó)家創(chuàng)造專利，申請(qǐng)?zhí)枺?3142073.7),球磨罐內(nèi)裝有用同種材料制成的磨塊;向該球磨罐內(nèi)注入模擬生物體液;震動(dòng)球磨得到顆?；鞈乙?。梯度離心獲得金屬顆粒。對(duì)顆粒進(jìn)展：(1)元素成分鑒定；(2)顆粒大小鑒定和粒度分析；(3)掃描電鏡對(duì)顆粒的外表形態(tài)觀察；(4)將顆粒與J774A.1巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察細(xì)胞吞噬顆粒的情況。結(jié)果通過(guò)此方法成功產(chǎn)生并別離出大量直徑1左右的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。(1)元素分析證實(shí)

2、整個(gè)處理過(guò)程中無(wú)雜質(zhì)成分污染；(2)鈦合金顆粒的平均直徑Dv901.009，鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv901.008，粒度分布曲線根本成正態(tài)；(3)掃描電鏡圖象顯示顆粒大小均勻，形狀多為不規(guī)那么，與體內(nèi)顆粒極為相似；(4)J774A.1巨噬細(xì)胞能完好吞噬2種材料的顆粒。結(jié)論此方法能持續(xù)大量產(chǎn)生人工關(guān)節(jié)假體金屬材料的磨損顆粒，產(chǎn)生的顆粒能在各方面很好地模擬體內(nèi)磨損顆粒，為今后人工關(guān)節(jié)假體松動(dòng)相關(guān)研究的體內(nèi)、體外研究提供可靠的顆粒來(lái)源?！娟P(guān)鍵詞】人工關(guān)節(jié)生物相容性材料磨損顆粒體內(nèi)研究體外研究Keyrds：artifitialjint;biehanialreeptiveaterial;earparti

3、le;inviv;invitr人工關(guān)節(jié)假體晚期松動(dòng)是長(zhǎng)期困擾骨科領(lǐng)域的難題。長(zhǎng)期的研究形成共識(shí)：假體材料磨損顆粒引發(fā)的由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的破骨細(xì)胞性骨吸收是假體松動(dòng)的主要生物學(xué)原因1。隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)2，3。為解決人工關(guān)節(jié)松動(dòng)相關(guān)研究中顆粒來(lái)源匱乏的問(wèn)題，本研究在參考Rgers4方法的根底上設(shè)計(jì)出一種體外產(chǎn)生生物金屬材料細(xì)小磨損顆粒的方法，采用此方法成功制成了直徑1的鈦合金和鈷鉻鉬合金顆粒。并對(duì)顆粒的成份、大孝形態(tài)和粒度分布進(jìn)展分析觀察。顆粒與巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)中觀察吞噬的方法初步驗(yàn)證顆粒用于

4、醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性。1材料與方法1.1顆粒制備裝置的研制原料選用醫(yī)用鈦鋁釩合金上海思愛(ài)高科技開(kāi)發(fā)提供和鈷鉻鉬合金北京力達(dá)康科技提供。采用非焊接技術(shù)制成3個(gè)中空的橢球形球磨罐1007070和立方形磨塊假設(shè)干555。頂部開(kāi)口處采用螺紋旋入式頂蓋，加用聚乙烯的墊圈，以進(jìn)步系統(tǒng)的密封性能，在設(shè)計(jì)上確保聚乙烯墊圈不外露于容器的內(nèi)壁，以防止混入聚乙烯磨損顆粒。底部支架使磨罐能在平面放置圖1、2。本裝置的所有組件按ASTF86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌121、15in后備用。生物金屬顆粒產(chǎn)生裝置及別離保存方法已申請(qǐng)國(guó)家創(chuàng)造專利。創(chuàng)造名稱：一種生物金屬材料超細(xì)粉末的制備方法及其制備裝置。專利申

5、請(qǐng)?zhí)枺?3142073.71.2磨損顆粒的制備、離心別離與保存無(wú)菌條件下翻開(kāi)頂蓋，將磨塊放入球磨罐中，參加事先配制好模擬生物體液PBS+2%小牛血清+5IU/l青霉素+5g/l鏈霉素75l作為光滑液。裝置至于搖床上，搖擺72h，棄掉光滑液，重新參加光滑液75l，搖擺21d。搜集光滑液與磨損顆粒的混懸液，加光滑液至80l待用。將鈷鉻鉬合金混懸液80l分裝在8個(gè)10l的試管中，500r/in離心2in，棄沉淀物，重新加光滑液至10l，重復(fù)2次。1000r/in離心5in，棄上清，重新加光滑液至10l,重復(fù)1000r/in離心5in1次，加光滑液至4l,-20凍存?zhèn)溆?。將鈦合金混懸?0l分裝在8個(gè)

6、10l的試管中，500r/in離心4in，棄沉淀物，重新加光滑液至10l，重復(fù)2次。1000r/in離心40in，棄上清，重新加光滑液至10l,重復(fù)1000r/in離心40in一次，加光滑液至4l,-20凍存?zhèn)溆谩?.3磨損顆粒成分元素分析隨機(jī)抽樣選取鈦鋁釩合金原料和磨損顆粒樣品各一份進(jìn)展元素分析。秤取0.1g原料和磨損顆粒樣品，于聚四氟乙烯燒杯中，參加10lHF分析純，加熱1h，參加10lH2S4(GR),加熱1h，定容于500l容量瓶中。取液進(jìn)入等離子體發(fā)射光譜儀IRISAdvantage1000美國(guó)，儀器自動(dòng)讀出樣品元素組成。1.4磨損顆粒的粒度分析1.5磨損顆粒的掃描電鏡觀察1.6巨噬

7、細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)J774A.1巨噬細(xì)胞株來(lái)源于BALB/小鼠網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤，由AerianTypeulturelletin.Rkville,D,USA提供，培養(yǎng)在含10%小牛血清、100g/l青霉素、100g/l鏈霉素和2%谷氨酰胺的DE培養(yǎng)液，于37、5%2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。搜集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以2105/l接種于6孔板中，培養(yǎng)46h后，參加體外制備的鈷鉻鉬合金顆?；鞈乙?07個(gè)/孔，另外于35培養(yǎng)皿中按上述方法接種細(xì)胞，刺激24h后用2.5%戊二醛溶液固定，進(jìn)展倒置相差顯微鏡觀察。同時(shí)設(shè)置不加任何刺激物的對(duì)照孔。1.7巨噬細(xì)胞透射電鏡觀察J774A.1巨噬細(xì)胞分別參加鈷鉻鉬合金顆?；?/p>

8、懸液和鈦鋁釩合金顆粒混懸液107個(gè)/孔，作用24h后用2.5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子將全部細(xì)胞從皿底輕輕刮下，搜集在離心管中離心2000r/in20in，棄上清，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊取出，用棉花紙包裹起來(lái)，然后進(jìn)展漂洗、1%鋨酸后固定15in、漂洗、脫水、浸透，將樣品從棉花紙內(nèi)取出進(jìn)展包埋，60烘箱內(nèi)48h，超薄切片，透射電鏡HITAHIH-500日本觀察并攝像。2結(jié)果2.1磨損顆粒成分元素分析分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)中獲得的鈦鋁釩合金顆粒的元素構(gòu)成與其原料根本一樣表1，證實(shí)磨損顆粒的產(chǎn)生過(guò)程中無(wú)雜質(zhì)元素污染。表1鈦鋁釩合金磨損顆粒的元素分析結(jié)果2.2磨損顆粒的粒度分析鈦鋁釩顆粒的平均直徑Dv901

9、.009，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間；鈷鉻鉬顆粒的平均直徑Dv901.008，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間；2種顆粒粒度分布曲線形態(tài)非常相似圖3、4。2.3磨損顆粒的掃描電鏡觀察鏡下可見(jiàn)體外制備的鈦鋁釩合金顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，外表有低密度的血清蛋白沉積圖5。未見(jiàn)明顯的顆粒疊加和成團(tuán)聚集的情況。大小顆粒在濾膜上分布不均勻，大顆粒集中在邊緣上，小顆粒集中在中心部位。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.體外制造的鈷鉻鉬合金顆粒也有片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，鈷鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大圖6。與體內(nèi)別離顆粒對(duì)照發(fā)現(xiàn)

10、，顆粒的形態(tài)均非常近似，外表都有蛋白沉積。體內(nèi)別離顆粒大小分布更加不均勻圖7。2.4巨噬細(xì)胞培養(yǎng)與吞噬實(shí)驗(yàn)J774A.1巨噬細(xì)胞經(jīng)適宜的條件培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，吞噬活性較強(qiáng)。倒置相差顯微鏡下細(xì)胞成圓形或橢圓形，細(xì)胞輪廓明晰，胞漿內(nèi)無(wú)明顯吞噬小體圖8。與體外制備的鈷鉻鉬顆粒共同培養(yǎng)24h后，鏡下細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞密度減小，細(xì)胞腫脹成圓形，胞核變大，甚至見(jiàn)到細(xì)胞大片壞死，核溶解，細(xì)胞碎裂，胞漿內(nèi)有被吞噬的鈷鉻鉬顆粒影像圖9。2.5培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞透射電鏡觀察當(dāng)金屬顆粒接近J774A.1巨噬細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞伸出偽足逐漸將較小的顆粒吞噬入細(xì)胞內(nèi)。此時(shí)細(xì)胞開(kāi)場(chǎng)張大，胞漿內(nèi)線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，表示

11、分泌活動(dòng)活潑，顆粒進(jìn)入細(xì)胞成為吞噬體。胞漿密度變得不均勻，有空泡樣變圖10。3討論為說(shuō)明假體松動(dòng)的機(jī)理和對(duì)新型假體材料的生物相容性進(jìn)展評(píng)價(jià)，眾多學(xué)者采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、體內(nèi)植入等方法對(duì)顆粒引發(fā)的生物學(xué)反響進(jìn)展研究57。由于體內(nèi)顆粒來(lái)源有限，國(guó)內(nèi)學(xué)者常采用簡(jiǎn)單的材料對(duì)磨、過(guò)篩或承受國(guó)外贈(zèng)送的方法體外獲得顆粒，而國(guó)外學(xué)者采用的方法有對(duì)磨illing、金屬熔體霧化aerslizatin、氣化gasatizatin、激光制粉法等4。由于來(lái)源雜亂，顆粒的各項(xiàng)特性變異較大，使大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)因無(wú)法重復(fù)和比擬而失去實(shí)際意義。如何體外產(chǎn)生生物金屬的顆粒并使之能很好地模擬體內(nèi)顆粒是一個(gè)普遍地急需解決的問(wèn)題

12、。大量的研究已經(jīng)顯示：磨損顆粒的物理、化學(xué)性質(zhì)是影響機(jī)體反響程度和假體松動(dòng)的關(guān)鍵因素。這些性質(zhì)包括：顆粒數(shù)量、大孝粒度分布、外表積、化學(xué)元素構(gòu)成、外表形態(tài)、可溶性金屬離子釋放、外表電荷等5。使體外生成的顆粒最大限度地模擬體內(nèi)磨損顆粒是作者設(shè)計(jì)這個(gè)方法時(shí)始終堅(jiān)持的原那么。3.1顆粒的產(chǎn)生方法人工關(guān)節(jié)周圍的金屬磨損顆?？梢詠?lái)源于關(guān)節(jié)面、柄-骨界面、假體-骨水泥界面、臼杯-骨界面、組合式假體的柄-頭結(jié)合處。從磨損機(jī)理上講屬于外表摩擦磨損，因此借鑒工業(yè)球磨的方法產(chǎn)生顆粒是合理的。作者自行設(shè)計(jì)的球磨罐具有以下特點(diǎn)：(1)采用一樣的材料加工球磨罐和磨塊，無(wú)焊接工藝和罐口的密封裝置防止了任何其它材料參與摩擦

13、，保證了顆粒的純潔；(2)光滑液采用PBS+2%小牛血清+5IU/l青霉素+5g/l鏈霉素，動(dòng)物血清對(duì)顆粒進(jìn)展預(yù)孵化(prEinubatin)，經(jīng)蛋白孵化的顆粒的生物學(xué)行為更接近體內(nèi)顆粒。在理論中作者發(fā)現(xiàn)，預(yù)孵化過(guò)程能在顆粒外表形成蛋白保護(hù)膜，明顯減少顆粒的聚集成團(tuán)現(xiàn)象，有利于顆粒的離心別離和電鏡觀察；(3)本裝置的所有組件按ASTF86-76標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展清洗，75%酒精浸泡，高溫滅菌，無(wú)菌操作過(guò)程和含抗生素的光滑液都保證了顆粒無(wú)微生物和內(nèi)毒素污染，這對(duì)于體內(nèi)和體外醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)是非常重要的；(4)低能量緩慢搖擺和光滑液的參加，使磨塊與罐壁、磨塊與磨塊之間進(jìn)展緩慢的摩擦，產(chǎn)生細(xì)小的顆粒，挑選效率進(jìn)步。3

14、.2顆粒的別離方法本實(shí)驗(yàn)采用“梯度離心的方法對(duì)顆粒進(jìn)展篩眩其原理來(lái)自于Stkes法那么：R2=9h/(2t-02n)R：顆粒半徑：光滑液黏滯度h：樣品高度t：離心時(shí)間：金屬密度0：光滑液密度：離心角速度n：樣品與旋轉(zhuǎn)軸間隔 本實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)變量只有和t，因此公式簡(jiǎn)化為：R2=4.5106/t(in)2(r/in)RTi2=9.0106/t(in)2(r/in)R：鈷鉻鉬合金顆粒半徑RTi：鈦合金顆粒半徑t：離心時(shí)間：離心角速度總之，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，利于應(yīng)用和推廣。3.3顆粒的粒度測(cè)定方法傳統(tǒng)的顆粒測(cè)定方法是在光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)展直接計(jì)數(shù)，工作量大、準(zhǔn)確度差。激光粒度儀利用測(cè)定激光

15、束穿透顆?；鞈乙旱纳⑸涔烙?jì)出顆粒的平均體積，如假設(shè)顆粒為標(biāo)準(zhǔn)球體，那么可計(jì)算出顆粒直徑。在應(yīng)用中作者認(rèn)為粒度儀用于人工關(guān)節(jié)顆粒分析的優(yōu)勢(shì)在于：測(cè)量速度快、誤差孝可定量分析、操作簡(jiǎn)單，非常合適大量樣本的檢測(cè)與比照研究。激光粒度儀是確定顆粒大小的有效方法，但在應(yīng)用中仍需注意：(1)激光粒度儀是在忽略顆粒形狀差異的根底上對(duì)顆粒大小的計(jì)算和估計(jì)，所以顆粒形狀對(duì)于結(jié)果有影響。光鏡或電鏡下對(duì)顆粒進(jìn)展直接計(jì)數(shù)的方法可以彌補(bǔ)上述缺乏，并可以獲得顆粒形態(tài)的直觀資料，兩者可以取長(zhǎng)補(bǔ)短；(2)由于金屬顆粒的密度大，在液體中沉降迅速，也給結(jié)果帶來(lái)偏向。所以注意別離好的顆?；鞈乙阂M快進(jìn)展測(cè)定，測(cè)定前再次震蕩混勻，有條

16、件時(shí)可以選取甘油等高黏度懸浮液。3.4開(kāi)展方向展望隨著各種新型生物金屬材料的不斷產(chǎn)生和人們對(duì)金屬-金屬和陶瓷-陶瓷人工關(guān)節(jié)假體的重新評(píng)價(jià)，細(xì)小金屬和陶瓷顆粒在假體松動(dòng)中的作用又成為了研究的熱點(diǎn)2，3。為適應(yīng)這一研究開(kāi)展的需要，作者正在研究能產(chǎn)生更加細(xì)小金屬和陶瓷顆粒直徑25n左右的方法。圖1鈦鋁釩合金球磨罐和磨塊圖2鈷鉻鉬合金球磨罐和磨塊圖3鈦鋁釩顆粒平均直徑Dv901.009，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間圖4鈷鉻鉬顆粒平均直徑Dv901.008，99.93%的顆粒直徑在0.31.2之間圖5體外人工制造的鈦鋁釩合金顆粒掃描電鏡顯示：顆粒呈片狀、盤狀、柱狀、針狀等各種不規(guī)那么形狀，外表有低密度的血清蛋白沉積2000圖6體外制備鈷鉻鉬合金顆粒掃描電鏡，鉻鉬合金顆粒更多為塊狀顆粒，是由于顆粒輕度聚集，顯得體積更大2000圖7體內(nèi)別離與體外制備的鈦鋁釩顆粒掃描電鏡比擬圖7aR為體內(nèi)別離顆粒圖7b為體外制備顆粒。顆粒的形態(tài)均非常