純甘油4℃保存方法對羊膜活性影響的研究

1、純甘油-4保存要領(lǐng)對羊膜活性影響的研究張軍崔巍高偉牧榮【摘要】目的：不雅察-4純甘油保存要領(lǐng)對羊膜活性的影響。要領(lǐng)：取康健剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦胎盤，剝離羊膜，分成22小塊，保存于-4純甘油中，3，7，14，30，60，90d后，別離舉行光鏡，酶構(gòu)造化學(xué)乳酸脫氫酶LDH、琥珀酸脫氫酶SDH及免疫構(gòu)造化學(xué)堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF不雅察，并于奇怪羊膜比擬。結(jié)果：光鏡下，-4純甘油保存60d以內(nèi)羊膜上皮層布局較完備，可見少數(shù)細(xì)胞破碎。胞核脫失。90d組上皮層布局粉碎顯著，多數(shù)細(xì)胞破碎，核脫失。酶構(gòu)造化學(xué)LDH、SDH及免疫構(gòu)造化學(xué)bFGF表現(xiàn)：60d內(nèi)各組于奇怪羊膜比力無明顯差異性；各組間兩兩比力亦無明顯

2、性差異P0.05。而90d組于奇怪比擬組及各實(shí)行組間兩兩比力均有明顯性差異P0.05。結(jié)論：羊膜在-4純甘油保存60d內(nèi)；構(gòu)造布局；上皮細(xì)胞活性不變?！娟P(guān)鍵詞】羊膜活性保存Effetfpreservatininglyerlat-4nanitiebranevitalityKEYRDS:anitiebrane;vitality;preservatin0弁言1995年Tseng1利用保存羊膜移植重修眼表得到樂成。羊膜移植治療眼表疾病已成為國表里眼科學(xué)者存眷的熱門。然而如今的研究多會合于羊膜移植的臨床結(jié)果和作用機(jī)制。有關(guān)羊膜保存要領(lǐng)及其對羊膜活性影響的報(bào)道甚少。我們應(yīng)用光鏡，酶構(gòu)造化學(xué)及免疫構(gòu)造化學(xué)要

3、領(lǐng)，探究-4純甘油保存要領(lǐng)對羊膜活性的影響，明白羊膜的有用保存時間。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料取HBsAg、衣原體、人免疫缺陷病毒及梅毒均為陰性的康健孕婦剖宮產(chǎn)所得到的胎盤，在無菌條件下將胎盤用無菌生理鹽水沖洗干凈。置于含青霉素50g/L、鏈霉素50g/L、新霉素100g/L、二性霉素B2.5g/L的生理鹽水中浸泡10in，鈍性剝離羊膜，使其與絨毛膜分散。將羊膜平鋪于粘貼手術(shù)巾的紙片上，羊膜的粗糙面與紙的粗糙面相貼，羊膜上皮面朝上2,3。然后將附有羊膜的紙片剪成2.52.5方形小塊，放入無菌純甘油3L的小瓶中，并置于-4冰箱中保存。bFGF兔抗人抗體，北京中山生物成品提供。S-P試劑盒，北京中山生

4、物工程提供。純甘油上海運(yùn)佳黃浦制藥提供，闡發(fā)純級。1.2要領(lǐng)40g/L中性甲醛結(jié)實(shí)，白臘包埋后一連切片8張4張免疫組化應(yīng)用，厚約4，HE染色后光鏡不雅察。將羊膜制成厚約8的冰凍切片，每個樣本切8張，每種酶4張此中一張為陰性比擬，行乳酸脫氫酶LDH、琥珀酸脫氫酶SDH構(gòu)造化學(xué)染色。應(yīng)用圖象闡發(fā)體系VIDS-21軟件，隨機(jī)測定8個高倍鏡視野中羊膜上皮層光密度均勻值。免疫構(gòu)造化學(xué)染色AB法：白臘切片脫蠟至水，自來水沖洗23in；雙蒸水2次2in。滴加bFGF一抗兔IgG，稀釋度1200，37水浴箱內(nèi)孵育1.5h，0.01l/LPBS洗2in3次，PBS取代一抗染色作為陰性比擬。滴加生物素化山羊抗兔I

5、gG稀釋度1300，37水浴箱內(nèi)20in，0.01l/LPBS洗2in3次。DAB顯色，鏡下操縱反響時間。脫水，透明，封片。圖象闡發(fā)體系VIDS-21軟件隨機(jī)丈量8個高倍鏡視野羊膜上皮層的光密度值。陰性比擬以PBS取代一抗。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰：利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)處置懲罰軟件，接納重復(fù)丈量資料的方差闡發(fā)，將各組結(jié)果均勻值行單因素方差闡發(fā)P0.05表現(xiàn)有明顯性差異。2結(jié)果2.1光鏡不雅察羊膜分3層，自內(nèi)向外為單層立方上皮細(xì)胞、厚而一連的基底膜和疏松的海綿狀層，含成纖維細(xì)胞，無血管漫衍，此中膠原纖維富厚且一連，彈性纖維少。純甘油-4保存羊膜3，7，14，30，60d羊膜上皮細(xì)胞層和基底膜較完備，少

6、數(shù)上皮細(xì)胞可見核固縮，及空泡變性，但正常形態(tài)上皮細(xì)胞照舊富厚。90d表現(xiàn)絕大數(shù)上皮細(xì)胞內(nèi)空泡增多，顯著的核固縮及核溶解，上皮細(xì)胞破碎喪失，乃至基底膜變薄，出現(xiàn)斷裂。2.2酶構(gòu)造化學(xué)測定LDH漫衍于細(xì)胞質(zhì)中，呈藍(lán)色顆粒，SDH漫衍于細(xì)胞質(zhì)中，呈紫赤色顆粒。保存3，7，14，30，60d，與奇怪比擬組及各實(shí)行組間比力均無明顯性差異P0.05；而90d組與奇怪比擬組及其他各實(shí)行組間比力均有明顯性差異P0.05，表1。2.3免疫構(gòu)造化學(xué)染色bFGF漫衍于羊膜上皮層和基質(zhì)層，染色以一連的棕黃色為陽性漫衍，陰性比擬未見染色。360d實(shí)行組與奇怪比擬組及各組間比力均無明顯性差異P0.05；而90d組與奇怪比

7、擬組及其他各組間比力均有明顯性差異P0.05。圖1保存60d羊膜上皮層LDH酶構(gòu)造化學(xué)染色400圖2保存60d羊膜上皮層SDH酶構(gòu)造化學(xué)染色4003討論比年來，隨著羊膜移植在治療眼表疾病中的明顯療效，羊膜日益成為眼表重修中的緊張生物學(xué)質(zhì)料4,5。然而，奇怪羊膜難以滿意臨床需求，以是羊膜的保存要領(lǐng)及其對羊膜活性影響研究也越發(fā)緊張。我們探究了-4純甘油保存要領(lǐng)對羊膜活性的影響；明白-4純甘油有用保存期提供引導(dǎo)；為術(shù)者選擇優(yōu)質(zhì)羊膜，進(jìn)步羊膜移植療效提供客不雅根據(jù)。有的學(xué)者6以為-4純甘油保存的羊膜無細(xì)胞活性，僅為基底膜。用保存羊膜移植僅是無細(xì)胞活性的基底膜移植。但本實(shí)行研究提示：-4純甘油保存法60

8、d內(nèi)的羊膜，其構(gòu)造布局和上皮細(xì)胞內(nèi)LDH，SDH，bFGF等活性物質(zhì)的表達(dá)維持在一相對不變的程度，與奇怪羊膜比擬組及各實(shí)行組之間比力均未見明顯差異性P0.05。而90d保存組與奇怪比擬組及其他實(shí)行組之間比力均有明顯差異性P0.05。這表白-4純甘油保存的羊膜并非無細(xì)胞活性的基底膜，而是具有活性上皮細(xì)胞的全層構(gòu)造。我們的研究提示：-4純甘油保存羊膜60d內(nèi)的上皮層布局，縱然有部門上皮細(xì)胞核固縮存在，但未影響上皮細(xì)胞內(nèi)LDH，SDH，bFGF等活性物質(zhì)的表達(dá)。此中SDH為有氧代謝的緊張酶，LDH為無氧酵解的關(guān)鍵酶。他們的表達(dá)強(qiáng)弱對羊膜上皮層細(xì)胞活性的表達(dá)至關(guān)緊張。而bFGF漫衍于羊膜上皮層和基質(zhì)層。研究表白bFGF在細(xì)胞，器官造就中均能有用地促進(jìn)角膜上皮再生，改進(jìn)角膜愈合質(zhì)量7-9。實(shí)行創(chuàng)造，bFGF能促進(jìn)角角膜后基質(zhì)的修復(fù)，低落炎癥反響程度，改進(jìn)修復(fù)質(zhì)量，維持角膜透明并促進(jìn)損傷區(qū)角膜基質(zhì)纖維的板層化擺列趨勢，從而