瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對肺癌基因蛋白表達的影響

1、瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對肺癌基因蛋白表達的影響【摘要】目的討論瑞香狼毒和腫瘤壞死因子(TNF)對肺癌細胞基因蛋白表達的影響。方法用瑞香狼毒水提取物和TNF分別及結(jié)合處理肺癌細胞株NI-H157和NI-H446，用免疫組織化學(xué)SP法分別檢測用藥前后肺癌細胞中多藥耐藥相關(guān)蛋白(D2)、肺耐藥蛋白(LRP)和熱休克蛋白27(HSP27)的表達狀況。通過形態(tài)學(xué)圖像分析，比擬瑞香狼毒和TNF用藥前后三種基因蛋白表達的差異。結(jié)果用藥前后兩種肺癌細胞株3種基因蛋白表達情況如下：瑞香狼毒組NI-H446細胞株用藥后LRP和D2陽性細胞灰度值均高于用藥前(P0.05)；HSP27的表達用藥前后差異無顯著性

2、(P0.05)。NI-H157細胞株用藥后LRP和HSP27陽性細胞灰度值均高于用藥前(P0.05)；D2的表達用藥前后差異無顯著性(P0.05)。TNF組NI-H446細胞株用藥后LRP陽性細胞灰度值高于用藥前(P0.05)；HSP27和D2的表達用藥前后差異均無顯著性(P0.05)。NI-H157細胞株用藥后LRP，D2和HSP27陽性細胞灰度值均高于用藥前(P0.05),其中LRP具有高度顯著性(P0.01)。結(jié)合用藥組NI-H446細胞株用藥后LRP和D2陽性細胞灰度值均高于用藥前(P0.05),HSP27的表達用藥前后差異無顯著性(P0.05)。NI-H157細胞株用藥后LRP、D2

3、和HSP27陽性細胞灰度值均高于用藥前(P0.05),且LRP和HSP27差異具有高度顯著性(P0.01)。結(jié)論瑞香狼毒提取物和腫瘤壞死因子對兩種肺癌細胞株的某些基因蛋白的表達具有抑制作用；兩種藥物結(jié)合應(yīng)用對基因蛋白的表達有明顯的抑制作用。【關(guān)鍵詞】瑞香狼毒腫瘤壞死因子肺癌細胞株基因蛋白TheEffetsfExtratsfrRuixianglangduandTuurNersisFatrfExpressinfGenePrtEininTLungarinaellAbstrat:bjetiveTresearhtheeffetfextratsfrRuixianglangduandtuurnersisfa

4、tr(TNF)nexpressinfgeneprtein.ethdsTlungarinaellstrainseretreatedithextratsfrRuixianglangduandTNF,theexpressinsfD2,LRPandHSP27inlunganerellstrainseredetetedithiunhistheistrySPassaybefreandafterbeingtreatedrespetively.Tparethedifferenefexpressinfthreekindsfgeneprteinithrphlgialiageassay.ResultsThediff

5、erenefexpressiveintensityfD2,LRPandHSP27beteenbefreandafterbeingtreatedithextratsfrRuixianglangduandTNFintlungarinaellstrainsasflls.InRuixianglangdugrup:inlungarinaellstrainNI-H446theexpressiveintensityfLRPandD2erehigherthanthatbefretreated(P0.05),exeptHSP27(P0.05).InNI-H157theexpressiveintensityfLR

6、PandHSP27erehigherthanthataftertreated(P0.05)，exeptD2(P0.05).InTNFgrup:theexpressiveintensityfLRPashigherthanthatbefretreatedithTNF(P0.05).ThedifferenefexpressiveintensityfHSP27,D2ereinapparentbefreandaftertreatedithTNF(P0.05).Inbinatingrup:therestrainingeffetfexpressinfgeneprtein(D2,LRPandHSP27)ere

7、nsuinginNI-H446andNI-H157strains(P0.01).nlusinTheextratsfRuixianglangduandTNFrestraintheexpressinfertainkindsfgeneprteinintlungarinaellstrains.Therestrainingeffetfexpressinfgeneprteinarensuinginbinatingrup.Keyrds:Ruixianglangdu;TuurnersisfatrTNF；Lungarinaellstrains;Geneprtein受人口老齡化、環(huán)境污染、吸煙、職業(yè)等因素的影響，

8、肺癌已成為我國癌癥死亡病因的首位，其發(fā)病率及病死率均呈顯著上升趨勢。由于肺癌患者早期診斷比擬困難，多數(shù)患者確診時已屬晚期，失去手術(shù)時機。因此化療仍是多數(shù)肺癌患者的主要治療方法。本文通過討論瑞香狼毒和TNF對肺癌相關(guān)基因蛋白表達的影響，探尋進步肺癌患者化療效果的新方法和新途徑?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。1材料與方法1.1中藥提取瑞香狼毒采自河北北部，提取前經(jīng)專家鑒定確認(rèn)。將瑞香狼毒自然晾干取其根部粉碎，裝入容器中參加適量蒸餾水浸泡30in，加熱提齲瑞香狼毒水提藥物終濃度為5g/l生藥。1.2細胞培養(yǎng)兩個肺癌細胞株，即人小細胞肺癌NI-H446和人非小細胞肺腺癌NI-H157，購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)根底

9、醫(yī)學(xué)院細胞中心。1.3組化染色1.3.1免疫組化試劑肺癌耐藥蛋白(LRP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(D2)、熱休克蛋白27(HSP27)均為鼠抗人單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)。1.3.2藥物實驗兩種肺癌細胞株復(fù)蘇后在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化計數(shù)后移至六孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)24h預(yù)先在六孔培養(yǎng)板中置干凈蓋玻片。分3組給藥：即瑞香狼毒組、TNF組、(瑞香狼毒和TNF)結(jié)合用藥組。瑞香狼毒組每孔參加經(jīng)抽濾的瑞香狼毒水提物20l；TNF組每孔參加用培養(yǎng)基稀釋的濃度為2.5萬U/l的TNF17l；結(jié)合用藥組為以上兩組藥物之和；24h后檢測三種耐藥基因蛋白的表達情況，并進展圖像分析。1.3.3免疫

10、組化SP兩步法經(jīng)10%甲醛固定后水洗。3%H22室溫孵育10in。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5in，0.05%胰蛋白酶37消化30in。PBS浸泡5in，10正常山羊血清封閉，室溫孵育10in。傾去血清，滴加D2、LRP、HSP27一抗工作液，4孵育過夜。PBS沖洗，5in3次。滴加試劑1(plyerhelper，37孵育20in；PBS沖洗，5in3次。滴加試劑2(plyperxidase-anti-use/rabbitIgG)，37孵育20in；PBS沖洗，5in3次。DAB顯色劑顯色。自來水洗，復(fù)染，封片，鏡檢。陽性結(jié)果的斷定：經(jīng)DAB顯色后陽性目的為棕黃色。1.4觀察分析1.4.1計算方法

11、各組中每種條件3張玻片,每張玻片計數(shù)10個視野,再統(tǒng)計每種條件陽性細胞灰度值的均值s。1.4.2彩色形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)應(yīng)用北京航空航天大學(xué)圖像中心分析軟件。1.5統(tǒng)計學(xué)方法用藥前后組間樣本比擬采用t檢驗。2結(jié)果結(jié)果見表13。表1瑞香狼毒組兩肺癌細胞株中3種基因蛋白表達(輝度)的比擬略表2TNF組兩肺癌細胞株中3種基因蛋白表達(輝度)的比擬略表3結(jié)合用藥組兩肺癌細胞株中3種基因蛋白表達(輝度)的比擬略3討論祖國醫(yī)學(xué)典籍中記載瑞香狼毒盛產(chǎn)于河北、山西、四川等地,其性味苦、平、辛、有毒,入肝、肺、脾三經(jīng),有逐水、祛痰、破積、殺蟲之成效1。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對瑞香狼毒抗腫瘤方面的成效進展了深化研究，獲

12、得了打破性的進展。TNF是由激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生的一種可溶性多功能細胞因子,具有很強的抗腫瘤活性2。其抗腫瘤機制為:特異性地直接殺傷腫瘤細胞；誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡3；逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多耐藥,增加化療敏感性3；抗腫瘤血管生成4；增加免疫效應(yīng)細胞對腫瘤細胞的殺傷作用3。本研究結(jié)果顯示瑞香狼毒和TNF對兩種肺癌細胞株的3種基因蛋白的表達有明顯抑制作用，并且結(jié)合用藥組其抑制蛋白表達的作用明顯增強。提示瑞香狼毒和TNF阻斷/降低了耐藥基因產(chǎn)物的表達，即抑制了基因的活性。本研究選用的3種基因蛋白(D2、LRP和HSP27)是目前公認(rèn)的存在于對多種化療藥物耐受的惡性腫瘤中，與多種惡性腫瘤的耐藥有關(guān)58。國外有研究

13、顯示,LRP在非小細胞肺癌中的表達明顯高于小細胞肺癌,這與本研究結(jié)果相吻合。D2，LRP和HSP27基因及其表達的蛋白質(zhì)在多藥耐藥中各自的作用機制及其互相關(guān)系非常復(fù)雜,目前尚不明確。本研究說明,結(jié)合用藥組兩種肺癌細胞株中3種基因蛋白的表達明顯減弱，與用藥前相比有顯著差異(P0.05),提示在臨床上假如結(jié)合這兩種藥物治療肺癌可能會進步化療效果。結(jié)果還顯示兩種肺癌細胞株對瑞香狼毒組和TNF組的反響表現(xiàn)出細微的差異，個別耐藥基因的表達用藥前后差異無顯著性(P0.05)，提示盡管在不同病理類型的肺癌細胞中瑞香狼毒提取物和TNF均表現(xiàn)出降低肺癌細胞基因蛋白表達的作用，但其作用機制可能存在著差異，為深化提

14、醒瑞香狼毒和TNF降低肺癌細胞基因蛋白表達的作用機制，還需從基因和蛋白程度進一步研究證實?！緟⒖嘉墨I】1羅慧英，王愛勤.不同極性溶媒瑞香狼毒提取物的抗腫瘤活性比擬J.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2022，10(10):1140.2周清華，侯梅，李潞，等.新型重組人腫瘤壞死因子治療非小細胞肺癌的多中心期臨床隨機試驗J.中國肺癌雜志，2022，6(1)：42.3LeeKY,hang,QiuD,eta.lPG490(triptlide)peratesithtu-ernersisfatralphatindueapptsisintuerellsJ.JBilhe,1999,274:13451.4Lasek,Gierasz,KuK,eta.lPtentiatinftheznti-tureffetfatiyinDbyturnersisfatralphainie:rrelatinbeteeninvitrandvivresultsJ.IntJaner,1996,66:374.5HarrisL.D2splievariantsandthEirtherapeutiipliatinsJ.urranerDrugTargets.2022,5(1):21.6RayburnE,ZhangR,HeJ,angH.D2andhuanalignanies:expressin,linialpathlgy,prgnst