桑葚酵素發(fā)酵過程中活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性研究

1、PAGE 11 -桑葚酵素發(fā)酵過程中活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性研究桑葚作為藥食同源的水果，富含維生素、蛋白質(zhì)、微量元素及多種功能活性物質(zhì)1。桑葚功能性雖強，但果品運輸、貯藏中耗損大，除鮮食外，少部分被精深加工為果汁、果酒等，產(chǎn)品線單一2。酵素作為新興產(chǎn)品，有機酸、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，且發(fā)酵賦予了產(chǎn)品良好的口感和風(fēng)味，其清潔腸道、解酒護肝、抗氧化等功效深受消費者喜愛3。酵素制作工藝多采用自然發(fā)酵，為混菌發(fā)酵體系，其微生物組成和代謝過程復(fù)雜，品質(zhì)和風(fēng)味優(yōu)于接種發(fā)酵4。由于環(huán)境微生物的復(fù)雜性，導(dǎo)致酵素發(fā)酵機理不明確，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，不適合現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)。因此，對酵素自然發(fā)酵過程的理化

2、和功能成分進行監(jiān)測和分析，有助于探究酵素的自然發(fā)酵機理。本研究以自然發(fā)酵桑葚酵素為實驗對象，檢測傳統(tǒng)酵素發(fā)酵過程中主要活性成分的變化，了解酵素功能活性物質(zhì)的代謝規(guī)律，并分析各活性成分對產(chǎn)品抗氧化性產(chǎn)生的影響，旨在進一步認(rèn)識桑葚酵素的抗氧化機制，為改善自然發(fā)酵酵素工藝、減少損耗，及標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)桑葚酵素提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。1材料與方法1.1材料與試劑桑葚(購于宜賓農(nóng)貿(mào)市場)；白砂糖，市售一級；DPPH、ABTS，美國Sigma公司；福林酚、沒食子酸、蘆丁(AR級)，麥克林生化科技有限公司；有機酸標(biāo)準(zhǔn)品(草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸，HPLC級，純度99%)，上

3、海源葉生物技術(shù)有限公司。1.2儀器設(shè)備T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260infinity高效液相色譜儀，美國Agilent公司；HWS-12恒溫水浴鍋，上海喬欣科學(xué)儀器有限公司；0.22m水系濾膜，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司；AR1140電子天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司。1.3方法1.3.1桑葚酵素的制備桑葚用無菌水沖洗后，自然晾干，白砂糖用紫外照射45min，玻璃發(fā)酵罐高壓蒸汽滅菌。將桑葚與糖按質(zhì)量比21的比例混合，放入發(fā)酵罐中，密封后28避光發(fā)酵80d。分別于發(fā)酵0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、80d取樣，1000r/min離心10

4、min后，取上層發(fā)酵液置于-80冰箱中保存，待測。1.3.2桑葚酵素理化指標(biāo)的測定采用pH計測定pH值；還原糖含量的測定采用DNS法5；總酸含量的測定參照GB12456-2022食品中總酸的測定中的pH計電位滴定法。1.3.3主要抗氧化成分測定總酚的測定使用福林酚比色法6，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=5.547x+0.0022(R2=0.9996)計算總酚濃度，以沒食子酸的質(zhì)量計?？傸S酮的測定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法7，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001x+0.0054(R2=0.9993)計算總黃酮含量，以蕓香甙的質(zhì)量計。1.3.4體外抗氧化能力測定DPPH自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)

5、8的方法；OH清除能力測定參照文獻(xiàn)9的方法；ABTS陽離子自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)10的方法；還原力的測定參照文獻(xiàn)11的方法。1.3.5有機酸含量測定參照楊建飛等12的方法并加以改進。高效液相色譜條件：AgilentZORBAXSB-Aq(4.6mm250mm,5m)色譜柱，流動相A為KH2PO4溶液(pH=2.54)，流動相B為甲醇溶液，V(KH2PO4)V(甲醇)=955，進樣量10L，VWD檢測器，檢測波長210nm，流速0.4mL/min，柱溫30。1.4數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0進行皮爾遜相關(guān)性分析及主成分分析，采用SIMCA14.1對主成分的分圖進行繪制，采用Origin202

6、2、Excel繪制圖表。2結(jié)果與討論2.1發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化桑葚酵素發(fā)酵過程中還原糖、pH和總酸的變化如圖1所示。發(fā)酵的前30d，還原糖總體呈不斷下降的趨勢，從初始的532.71g/L下降到388.08g/L。而總酸呈不斷上升的趨勢，從初始的4.55g/L上升到28.69g/L，證明發(fā)酵體系中的微生物利用糖生長代謝，并產(chǎn)生以乳酸、乙酸為主的大量有機酸，同時使pH從初始的4.58下降至3.16。30d以后，還原糖、總酸基本趨于平穩(wěn)，表明微生物代謝減弱，發(fā)酵進入后熟階段。到發(fā)酵截止的80d內(nèi)，還原糖含量輕微浮動，可能是微生物分解利用桑葚原料中的糖類物質(zhì)引起的13。發(fā)酵結(jié)束時，總酸含量為26.

7、97g/L，其下降的原因可能是發(fā)酵液中的有機酸被氧化分解、形成脂類、被菌群作為碳源消耗等。a-還原糖含量；b-pH、總酸含量圖1不同發(fā)酵時間還原糖、pH、總酸含量的變化Fig.1Thechangeofreducingsugarcontent,pHandtotalacidcontent2.2發(fā)酵過程中主要抗氧化成分的變化桑葚酵素發(fā)酵過程中總酚、總黃酮的測定結(jié)果如圖2所示。在發(fā)酵5d，總酚和總黃酮急劇上升，可能是由于原料處理時，加糖攪拌使原料發(fā)生氧化，密封發(fā)酵后，部分多酚物質(zhì)的溶出導(dǎo)致的。5d后總酚和總黃酮減少的原因可能是酚類化合物與固形物、蛋白質(zhì)甚至酵母結(jié)合或吸附，導(dǎo)致了酚類化合物含量的下降14

8、。圖2桑葚酵素發(fā)酵過程中總酚、總黃酮含量的變化Fig.2Changesoftotalphenolandtotalflavonecontentsinmulberryfermentation隨著發(fā)酵的進行，某些大分子酚類物質(zhì)逐漸被微生物分解為小分子酚類化合物，使總酚和總黃酮濃度不斷增加15，在發(fā)酵40d時達(dá)到最大值，分別為3.42g/L和3.60g/L。40d后，總酚和總黃酮開始呈下降趨勢，可能是由于發(fā)酵時間過長，多酚類化合物發(fā)生非酶促反應(yīng)，進一步聚合16。此結(jié)果與前人研究結(jié)果相似17-18。2.3發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化由圖3-a所示，桑葚酵素DPPH自由基清除能力在發(fā)酵過程中緩慢上升，2

9、5d時，從初始的64.59%上升至最大值71.16%，之后開始有輕微的上下浮動，發(fā)酵結(jié)束時DPPH自由基清除能力為69.37%。偉仕靜等19研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中總酚的變化與其DPPH自由基清除能力之間有明顯的相關(guān)性，與本實驗結(jié)果相似。由圖3-b所示，桑葚酵素ABTS陽離子自由基清除能力25d內(nèi)從初始的59.31%迅速上升至73.41%，25d后緩慢上升，于50d時達(dá)到最大值74.04%，之后又略有下降，發(fā)酵結(jié)束時的清除能力為70.85%。桑葚酵素發(fā)酵過程中ABTS陽離子自由基清除能力的變化與總酚含量變化相似，HAGERMAN等20研究表明酚類化合物的聚合度、共軛度、酚類取代基的數(shù)量和排列以及分

10、子質(zhì)量在清除ABTS陽離子自由基上起著關(guān)鍵作用。由圖3-c所示，桑葚酵素OH清除能力在發(fā)酵的前30d明顯增強，于第30天達(dá)到最大值39.83%，相較初始的OH清除率19.28%，增長了106.58%。30d后，桑葚酵素的OH清除能力略有下降后趨于平穩(wěn)。OH清除率的變化可能是有機酸、酚類物質(zhì)、酵母代謝產(chǎn)物綜合作用的結(jié)果21。由圖3-d所示，發(fā)酵過程中桑葚酵素的還原力隨發(fā)酵時間增加，呈不斷上升然后趨于平穩(wěn)的趨勢，發(fā)酵結(jié)束時，桑葚酵素的還原力從初始的0.72上升到0.77。還原力的變化趨勢區(qū)別于其他抗氧化指標(biāo)的原因與其抗氧化機制相關(guān)。a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-OH

11、清除率;d-還原力圖3桑葚酵素發(fā)酵過程中體外抗氧化指標(biāo)的變化Fig.3ChangesofantioxidantindexesinvitroduringfermentationofmulberryJiaosu2.4發(fā)酵過程中有機酸種類和含量的變化對桑葚酵素有機酸含量進行測定，由圖4可知，桑葚原料不含丙酮酸，經(jīng)過發(fā)酵后，共檢出8種有機酸，其中酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的含量較高，最高含量分別達(dá)到11.02、13.77、9.63、4.02、2.57g/L，而草酸、丙酮酸、蘋果酸含量一直在1.0g/L以下變化，說明桑葚酵素中的主要有機酸可能是酒石酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸。乳酸和乙酸是有機

12、酸中占比最高、變化最大的酸。原料中乳酸和乙酸的含量分別為0.46g/L和0.77g/L，在發(fā)酵過程中先增加后減少，發(fā)酵結(jié)束時，其含量分別為11.10g/L和7.05g/L。因為乳酸菌和醋酸菌是酵素發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，發(fā)酵會產(chǎn)生大量的乳酸和乙酸，使總酸升高，pH值降低，從而又抑制了乳酸菌和醋酸菌的繁殖22。檸檬酸在發(fā)酵過程中沒有明顯的變化規(guī)律，這可能是因為檸檬酸參與三羧酸循環(huán)，在發(fā)酵過程中不易累積23。酒石酸作為桑葚原料中含量最多的有機酸，經(jīng)發(fā)酵后，呈先上升后下降的趨勢。酒石酸的增加可能是由于pH值的急劇降低和原料的溶出造成的，然后因氧化降解或沉淀而減少24。圖4桑葚酵素發(fā)酵過程有機酸含量的變

13、化Fig.4Changesoforganicacidcontentinmulberryfermentationprocess2.5發(fā)酵過程中各指標(biāo)與抗氧化的相關(guān)性分析及主成分分析2.5.1各指標(biāo)變化與抗氧化性活性的相關(guān)性分析表1展示了桑葚酵素發(fā)酵過程中各指標(biāo)變化與4種不同抗氧化活性的相關(guān)性，除檸檬酸外，其它成分與4種抗氧化指標(biāo)均呈極顯著的相關(guān)性(P0.01)。其中pH、還原糖與抗氧化能力呈極顯著的負(fù)相關(guān)，其他活性成分則與抗氧化能力呈極顯著的正相關(guān)(P0.01)。證明總酚、總黃酮類及有機酸含量對桑葚酵素的抗氧化活性有很大影響。表1桑葚酵素發(fā)酵過程中各成分與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性Table1Corre

14、lationbetweenantioxidantindexesandcomponentsinmulberryfermentationprocess注：*表示差異極顯著(P0.01)2.5.2主成分分析為進一步挖掘桑葚酵素活性物質(zhì)與抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性，應(yīng)用主成分分析法對上述指標(biāo)加以分析，得到主成分相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率如表2所示，2個主成分累積貢獻(xiàn)率為81.464%(80%)，基本包含大多數(shù)樣本信息。表2解釋的總方差Table2Thetotalvarianceexplained主成分分析載荷圖如圖5所示，各指標(biāo)之間相關(guān)性強的變量聚集在一起，距離越近，相關(guān)性越大。第3象限中，蘋果酸、丙酮酸、乙酸

15、、乳酸、總酸與OH清除能力具有很高的相關(guān)性，且與pH和還原糖呈極顯著的負(fù)相關(guān)。第2象限中，ABTS陽離子自由基清除率與總酚距離最近，說明二者相關(guān)性極顯著，除檸檬酸外，其余成分之間也存在一定的正相關(guān)性，此結(jié)果與上述相關(guān)性分析相似。圖5主成分分析載荷圖Fig.5Principalcomponentanalysisloadingplot主成分樣品得分圖如圖6所示。發(fā)酵0d和5d離其他位置相對較遠(yuǎn)，說明這2個樣品與其它樣品之間差異較大。發(fā)酵10、15d和20、25、30d在第2主成分上的差別都不大，但在第1主成分上，發(fā)酵10、15d得分為正值，20、25、30d得分為負(fù)值。發(fā)酵40、50、60、80d

16、主要集中在第2象限，各樣品之間無顯著差異。圖6主成分樣品得分圖Fig.6Scoringplotofprincipalcomponentsamples基于主成分分析法，對不同發(fā)酵時間桑葚酵素構(gòu)建綜合評價指數(shù)體系。以表2的兩個主成分對應(yīng)的方差相對貢獻(xiàn)率為權(quán)重，得到桑葚酵素綜合評價指數(shù)(comprehensiveevaluationindex,CEI)計算如公式(1)所示：(1)式中：CEI，綜合評價指數(shù)；PC1，第1主成分；PC2，第2主成分。不同發(fā)酵時間桑葚酵素樣品的綜合評價指標(biāo)如圖7所示，CEI在05d變化不大，可能是在高糖環(huán)境下，微生物處于適應(yīng)期。發(fā)酵515d，CEI迅速上升，發(fā)酵15d以后，CEI上升緩慢，到30d時達(dá)到最大值，為0.90。此后，CEI逐漸下降并趨于平穩(wěn)。參考CEI，可判斷桑葚酵素的發(fā)酵終點為30d。圖7桑葚酵素綜合評價指標(biāo)Fig.7ComprehensiveevaluationindexofmulberryJiaosu3結(jié)論對桑葚酵素發(fā)酵過程中的功能活性物質(zhì)及體外抗氧化能力變化進行分析，發(fā)現(xiàn)總酚和總黃酮呈先上升后下降的趨勢，于40d時分別達(dá)到最大值3.42g/L和3.60g/L，且多酚類物質(zhì)含量的變化與體外抗氧化能力變化呈顯著的正相關(guān)性；經(jīng)發(fā)酵，桑葚酵素中共檢出8種有機酸，酒石酸、乳