(整理)微生物工業(yè)菌種與培養(yǎng)基

1、精品文檔精品文檔微生物工業(yè)菌種與培養(yǎng)基菌種與種子擴大培養(yǎng)菌種：實現(xiàn)從原料一目的產(chǎn)物的關鍵生產(chǎn)效率、產(chǎn)品成本、產(chǎn)品質(zhì)量1微生物工業(yè)用菌對苗種的要求常用的工業(yè)微生物菌種保藏2種子護大將秦修身觸蚪種:?楸fBS例乳生物不到總數(shù)的1%,時若干年的研究重點;1%,時若干年的研究重點;誘變育種：誘變是工業(yè)發(fā)酵穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的重要保證;基因重組：基因定向改造技術大大加快了生物產(chǎn)品開發(fā)的進程。X從自然界中分離菌種的一般過程采樣預處理培養(yǎng)一菌落的選擇一產(chǎn)品的鑒定X選擇育種方法時綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關系(2)對這一特定菌種的遺傳生化的認識程度(3)經(jīng)濟費用如，對特定菌種的基本性狀及其工藝知

2、曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術；如，對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。X一些常用工業(yè)微生物抗生素生產(chǎn)有關的微生物放線菌(鏈霉素真菌(青霉素、頭孢等)四環(huán)素；紅霉素等)一些產(chǎn)芽孢的細菌植物或動物來源X氨基酸生產(chǎn)有關的微生物氨基酸生產(chǎn)菌的要求：代謝途徑比較清楚，代謝途徑比較簡單；谷氨酸發(fā)酵的菌種：棒桿菌屬，短桿菌屬、節(jié)桿菌屬或小桿菌屬的棒型細菌；其它氨基酸生產(chǎn)菌：常規(guī)菌種一般也是以谷氨酸生產(chǎn)菌選育而成；工程菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌。X食品工業(yè)微生物包括：釀造業(yè)，酶制劑等食品用的微生物需經(jīng)過嚴格的毒理試驗，目前已同意使用的僅僅少數(shù)微生物能

3、用于生產(chǎn)食品用酶。a淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢桿菌和地衣牙孢桿菌。2、工業(yè)微生物（菌種）的要求1）能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長和大量合成目的產(chǎn)物-價值高2）能在要求不高、易控制的培養(yǎng)條件下迅速生長和發(fā)酵，發(fā)酵周期短。-可操作性強3）根據(jù)代謝調(diào)控要求選擇高產(chǎn)菌株，如營養(yǎng)缺陷型菌株或調(diào)節(jié)突變型菌株4）菌種抗噬菌體能力強，以防止感染噬菌體而造成“倒罐”現(xiàn)象的發(fā)生。5）菌種純粹，不易退化，可保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。-遺傳穩(wěn)定性強6）菌種非病原菌，不產(chǎn)生任何有害的物質(zhì)和毒素，以保證產(chǎn)品的安全。-安全性強3、工業(yè)微生物菌種保藏技術（1）斜面保藏：3-6個月；（2）沙土管干燥保藏

4、：2年；（3）液氮保藏：2-3年；（4）懸液保藏：常溫或低溫；（5）超低溫保藏：1年以上；（6）冷凍干燥保藏：5-10年。派菌種保藏目的：保證菌種在長時間內(nèi)盡可能保持原有菌株優(yōu)良的生產(chǎn)性能?；驹恚焊鶕?jù)菌種的生理生化特點，創(chuàng)造條件使菌種的代謝活動處于不活潑的狀態(tài)?；驹瓌t：選用優(yōu)良純種和創(chuàng)造一個最有利于菌種休眠的環(huán)境。休眠環(huán)境：微生物生長繁殖和代謝受抑，不易突變的環(huán)境，一般要求低溫、缺氧、缺營養(yǎng)、添加保護劑、干燥等。保藏要求：保持菌種優(yōu)良特性，經(jīng)濟方便保藏后需再次檢測和確定保藏菌種的形態(tài)學和生化特征（如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化指標）。方法溫度保護劑保藏時間適用菌種定期移植低溫保

5、藏法4低溫無數(shù)月，短期各種微生物細胞液氮超低溫保藏法-196-150甘油或DMSO長期適用范圍最廣，微生物、動物細胞甘油低溫-80-70甘油1年以上特別適用于基因保藏法(-18)工程菌沙土保藏法室溫或低溫數(shù)年芽孢桿菌、放線菌、曲霉菌等麩皮保藏法20長期放線菌、霉菌等蒸餾水保藏法工410較長時間酵母、真菌冷凍干燥保藏法干燥后，4左右低溫L避光處脫脂乳、蔗糖數(shù)年各種微生物細胞波靠超低溫保贏成X最有效，適用范圍最廣，多數(shù)國家級菌種保藏單位常用原則：慢凍快溶原理：利用微生物在-130以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。.將10%甘油或DMSO作為保護劑分裝與安培瓶（or凍干管）中；.將長有菌落的瓊

6、脂（or培養(yǎng)液）懸浮于已滅菌的保護劑中；.熔封安培瓶口（or蓋上凍干管的蓋子）。以1min下降1的速度降至-35,使瓶內(nèi)懸浮液體凍結(jié)，然后將安培瓶置液氮罐（or液氮冰箱）中，于-130以下儲藏；恢復培養(yǎng)時，從液氮中取出安培瓶（or凍干管），立即于3840水浴中搖動，至瓶內(nèi)冰全部融化，按常法進行培養(yǎng)。液氯保炭法攆隹步驟X在超低溫冷藏柜（-70-80）中保藏菌種的一般方法是:.離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞.用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；.加入等體積的20%甘油或10%二甲亞砜；精品文檔精品文檔精品文檔精品文檔精品文檔精品文檔.混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70-80超低溫冰箱中保

7、藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2/min。一些細菌和真菌菌種可保藏5年而活力不受影響?？傋】傌?日的小城門方便肅海下*5走向氣任平通？IM方便場口領班兩不總住總鬲1日的小城門方便肅海下*5走向氣任平通？IM方便場口領班兩不鉛軍惻幗.可葡UV卷西度.科fiSUPMC門口玨山計，飴在一t*寧外的至安/俳力冷制ixS.利物定自護對*河靜鼓理方式金不H5相社手BI_,13Is._is-一善Hcnivbn.輕變蓑爰口的值松意范亍冰凍干保藏：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。此法是微生物菌種長期保藏的非常有效的方法之一。冰冷凍干燥步驟：凍干樣品的準備：準備菌種，與保護劑

8、混合均勻，分裝至安瓿管；預凍：2小時以上，溫度達到-20到-35左右；冷凍干燥：8-20小時；真空封口及真空檢驗：安瓿管頸部用強火焰拉細熔封。氯化鉆溶液檢測真空度；低溫避光保藏：4。冰凍干保藏特點：凍干狀態(tài)下一般可保藏10年不喪失活力；凍干后的菌株可常溫保存；便于運輸；必須使用冷凍保護劑，常用脫脂乳、蔗糖等。X保藏機構(gòu)國外：ATCCAmericanTypeCultureCollection.RockvilleMaryland.U.S.A美國標準菌種收藏所，美國，馬里蘭洲，羅克維爾市。CSH(ColdSpringHarborLaboratory),U.S.A冷泉港研究室，美國。IAM(Insti

9、tuteofAppliedMicrobiology),UniversityofTokyo,Japan日本東京大學應用微生物研究所，日本東京。IFO(InstituteforFermentation),Osaka,Japan發(fā)酵研究所，日本大阪。KCC(KakenChemicalCompanyLtd,Tokyo,Japan科研化學有限公司，日本東京。NCTC(NationalCollectionofTypeCulture),LondonUnitedKingdom，國立標準菌種收藏所，英國倫敦。NIH(NationalInstitutesofHealth),Bethesda,Maryland,U.

10、S.A國立衛(wèi)生研究所，美國，馬里蘭洲，貝塞斯達。NRRL(NorthernUtilizationResearchandDevelopmentDivision),U.S.DepartmentofAgriculture,Peoria,U.S.A美國農(nóng)業(yè)部、北方開發(fā)利用研究部，美國皮奧里亞市。中國，1970年7月，中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCMS)，中國科學院負責，下設六個菌種保藏管理中心。l)CCGMC普通微生物菌種保臧管理中心；北京、武漢2)ACCC農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；北京3)CICC工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；北京4)CMCC醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心；南京、北京5)CACC抗

11、生素菌種保藏管理中心；北京、成都、石家莊6)CVCC獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；北京衰退的表現(xiàn)僦僦獻薛力、繁殖力、產(chǎn)物得率衰退的表現(xiàn)僦僦獻薛力、繁殖力、產(chǎn)物得率I衰退的原因：保藏不妥，菌種生長的要求沒有得到滿足(不利環(huán)境，回復突變等);防止衰退的方法：.分離復壯.合理改變培養(yǎng)條件.減少傳代次數(shù).誘變劑處理后重新分離單菌落復壯：分離單細胞，抗性篩選，苛刻條件派將保存在沙土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)，最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。菌種擴培的目的提供相當數(shù)量代謝旺盛的種子-量、狀態(tài)的需要；菌種擴培的任務得到

12、純、壯、多的培養(yǎng)物精品文檔精品文檔-菌種的馴化；-縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平。X種子擴培的兩個階段實驗室階段：不用種子罐，所用的設備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此將其稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。培養(yǎng)基：保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，有利于菌體的生長；減少傳代次數(shù)孢子培養(yǎng)時注意濕度，子斜面使用一般不超過1個月。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工廠歸發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。培養(yǎng)基：控制成本，馴化；營養(yǎng)比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。X三級發(fā)酵流程：斜面一一級種子一二級種子罐一三級種子罐一發(fā)酵罐X靜置培養(yǎng)法：嫌氣發(fā)酵液體培養(yǎng)法通氣培養(yǎng)法/表

13、面培養(yǎng)法L固態(tài)培養(yǎng)法a*表面培基成精品文檔精品文檔精品文檔精品文檔iFA釋特內(nèi)廣適用范圍固態(tài)培養(yǎng)即曲法培養(yǎng)，源于傳統(tǒng)制林木酶活力高可調(diào)溫濕度釀造業(yè)液體深層培養(yǎng)液體培養(yǎng)，深層通風可調(diào)節(jié)各種環(huán)境因素：營養(yǎng)物濃度，溫濕度等；無菌操作要求高幾乎所有好氣發(fā)酵：如有機酸、氨基酸等載體培養(yǎng)可重復使用的多孔材料，嚴格控制營養(yǎng)條件，結(jié)束后擠壓培養(yǎng)液抽提產(chǎn)物兼具固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法的優(yōu)點可培養(yǎng)霉菌、酵母、放線菌等兩步法液體深層培養(yǎng)將營養(yǎng)生長期與生產(chǎn)期分開，分別控制不同條件工藝可達到最優(yōu)過程繁瑣氨基酸生產(chǎn)*2,2整響種子質(zhì)品的因|索派種子的要求：總量及濃度能滿足要求；生理狀況穩(wěn)定，個體與群體；活力強，移種至發(fā)酵后

14、，能夠迅速生長；無雜菌污染。X種子的質(zhì)量控制：一定的濃度；形態(tài)（生長）處于某個階段、均勻等等；理化指標：C、N、P的含量，pH，酶活等;無污染；通氣與攪拌；泡沫；染菌的控制；種子罐級數(shù)。X種齡種齡是指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。X接種量的確定：移入種子的體積接種量=接種后培養(yǎng)液的體積過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為7-15%。但是一般認為大一點好。雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。X發(fā)酵級數(shù)的

15、確定：一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)X確定依據(jù)：發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，難管理，一般2-4級；谷氨酸的三級發(fā)酵：一級種子（搖瓶）一二級種子（小罐）一發(fā)酵青霉素的三級發(fā)酵：一級種子（小罐）一二級種子（中罐）一發(fā)酵2.3種子擴大培養(yǎng)舉例例一、谷氨酸生產(chǎn)的種子制備：斜面菌種一一級種子培養(yǎng)一二級種子培養(yǎng)一發(fā)酵1、斜面（ASL299）培養(yǎng)基：蛋白胨1%,牛肉膏1%,氯化鈉0.5,瓊脂2%,pH7.0-7.2培養(yǎng)條件：32,生長18-24小時培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細生長斜面要求：生長良好，所使用斜面連續(xù)傳

16、代不超過3次.、一級種子（搖瓶）培養(yǎng)基：葡萄糖2%,尿素0.5%,玉米漿2.5%,K2HPO40.1%培養(yǎng)條件：于1000ml三角瓶中，裝液200-250ml,32培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。.二級種子（種子罐）培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為2.5%培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%）,32培養(yǎng)7-10個小時培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。X種子的質(zhì)量要求：108-109個/ml、大小均勻，呈單個或八字排列，pH7.0-7.2時結(jié)束，6.8-8f7.0-72，活力旺盛。例二、青霉素生產(chǎn)的種子制備安瓿管一斜面孢子一大米孢子一一級種子-二級種子一發(fā)酵1.斜面孢子培養(yǎng)基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)條件：25、7天，注意濕度50%左右培養(yǎng)基特點：有利于長孢子，用量少而精細2.大米孢子O培養(yǎng)基：大米及氮源（玉米漿）O培養(yǎng)條件：25、7天，控制濕度O培養(yǎng)基的特點：成本低、米粒之間結(jié)構(gòu)疏松提高比表面積和氧的傳質(zhì)，營養(yǎng)適當（要求大米的白點?。┯?/p>